載脂蛋白E基因多態性與原發性高血壓伴周圍動脈硬化閉塞癥的關系

劉建偉 葉 玲 劉 靜 李小鷹 (解放軍總醫院老年醫學研究所，北京 100853)

有研究證實，高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化和吸煙等為周圍動脈硬化閉塞癥(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)的主要危險因素〔1〕，載脂蛋白E(ApoE)參與調節機體脂質代謝，其基因多態性與動脈粥樣硬化有關〔2〕。本研究采用多重四引物擴增受阻突變體系PCR法(multiplex tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，multiplex T-ARMS PCR〔3〕)，對北京市萬壽路社區健康老年人、老年原發性高血壓(essential hypertension，EH)、老年周圍動脈硬化閉塞癥(PAOD)和老年EH伴PAOD病例中ApoE基因多態性進行分析，探討這一基因變異與EH和PAOD的關系，以期闡明遺傳易感因素在其發病機制中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選自“2002年北京市萬壽路社區老年周圍動脈硬化閉塞癥流行病學調查”人群(2 124例)。健康老年人(NC組)100例，漢族，男50例，女50例，年齡60～81〔平均(66.3±4.4)〕歲;老年EH組100例，漢族，男50例，女50例，年齡60～82〔(平均67.2±4.2)〕歲;老年 PAOD組83例，漢族，男28例，女55例，年齡60～86〔平均(69.3±3.7)〕歲;老年EH伴PAOD組59例，漢族，男17例，女42例，年齡60～85〔平均(70.2±3.0)〕歲。

篩選標準:NC組為經病史、體格檢查、心電圖及實驗室檢查排除了冠心病(參照1979年WHO頒布的診斷標準)、糖尿病(參照1997年ADA頒布的診斷標準)、高血壓(參照1999年中國高血壓防治指南頒布的診斷標準)以及PAOD等心腦血管疾病的健康人群。EH組診斷標準參見NC組，排除繼發性高血壓、冠心病、糖尿病以及PAOD，收縮壓(SBP)≥140 mmHg和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg。PAOD組診斷標準參照文獻〔4〕，排除高血壓、冠心病和糖尿病。EH+PAOD組診斷標準參見EH和PAOD組，排除繼發性高血壓。

1.2 研究方法 經典酚-氯仿抽提法提取全血DNA。采用multiplex T-ARMS PCR法檢測ApoE基因型，引物參照文獻設計〔3〕，由上海英駿生物工程技術服務有限公司合成，序列為:FO:5'-ACTGACCCCGGTGGCGGAGGA-3';RO:5'-CAGGCGTATCTGCTGGGCCTGCTC-3';FI-1:5'-GGCGCGGACATGGAGGACGgGC-3';RI-1:5'-GCGGTACTGCACCAGGCGGCCtCA-3';FI-2:5'-CGATGCCGATGACCTGCAGA c GC-3';RI-2:5'-CCCGGCCTGGTACACTGCCAG t CA-3'。其中FI-1和 RI-1分別用于檢測ApoE基因第112位精氨酸(Arg112)密碼子cGC的C和第112位半胱氨酸(Cys112)密碼子tGC的T，擴增片段長度為:FI-1/RO 444 bp和FO/RI-1 115 bp;FI-2和RI-2分別用于檢測ApoE基因第158位精氨酸(Arg158)密碼子cGC的C和第158位半胱氨酸(Cys158)密碼子tGC的T，擴增片段長度為:FI-2/RO 307 bp和FO/RI-2 253 bp。為了監控反應體系的有效性，以FO/RO為內參照系統，擴增片段長度為514 bp。PCR擴增條件:反應體系 20 μl，95℃ 預變性 15 min 后，95℃ 30 s，66℃30 s，72℃ 30 s，共35 個循環，最后于 72℃再延伸 7 min。PCR擴增儀為Biometra Tgradient，TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶為大連寶生物工程有限公司產品。反應完成后，2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，以DL2000 DNA分子量標準物為參考判定PCR結果。對所有受檢者同時進行血脂、血糖、血壓、血漿纖維蛋白原(FIB)、體重指數(BMI)及聽覺誘發電位指數(AAI)等的檢測。

1.3 統計學處理 使用SPSS13.0統計軟件進行處理，計量資料以±s表示，基因頻率采用基因計數法，基因型及基因頻率比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 一般情況比較 PAOD組和EH+PAOD組AAI值顯著低于NC組和EH組(P＜0.05);EH+PAOD組和EH組SBP顯著高于NC組(P＜0.05);其余指標(血脂、血糖、FIB、BMI)的水平，三組間無顯著性差異。見表1。

2.2 ApoE六種基因型頻率及三種等位基因頻率的比較 內參照基因514 bp條帶清晰，檢測樣品均成功擴增出目的條帶。共檢測出6種基因型，每一個純合子有兩個不同長度的片段。ε2/2基因型顯示253 bp(Cys158)和115 bp(Cys112)條帶，ε3/3基因型顯示307 bp(Arg158)和115 bp(Cys112)條帶，ε4/4基因型顯示444 bp(Arg112)和307 bp(Arg158)條帶。雜合子ε4/2基因型擴增出4個條帶，其他兩個雜合子各擴增出3個條帶，ε3/2擴增出除444 bp以外的條帶，ε4/3擴增出除253 bp以外的條帶。NC組、EH組、PAOD組和EH+PAOD組ApoE各基因型頻率及等位基因頻率分布均無顯著性差異(P＞0.05)。見表2，圖1。

表1 NC、EH、PAOD與EH+PAOD組一般情況比較(±s)

表1 NC、EH、PAOD與EH+PAOD組一般情況比較(±s)

與NC組比較:1)P＜0.05;與EH組比較:2)P＜0.05;與PAOD組比較:3)P＜0.05

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表2 NC、EH、PAOD與EH+PAOD組ApoE各基因型頻率及等位基因頻率分布〔n(%)〕

圖1 ApoE等位基因Multi-ASP-PCR圖譜

3 討論

ApoE是由299個氨基酸組成的糖蛋白，分子量34.2 kD，主要存在于血漿乳糜微粒、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中。ApoE作為ApoE受體與低密度脂蛋白(LDL)受體的配基，能高親和性地與這兩種受體結合，是調節機體脂質代謝的重要因素。Utermann等〔5〕的研究表明，ApoE基因位于第19號染色體上，該基因第4外顯子內編碼第112位氨基酸及第158位氨基酸的密碼子具有多態性，可產生三種常見的等位基因:ε4、ε3和ε2，分別編碼 Apo E 的三種主要異構體 ε2、ε3和 ε4，其中 ε3是人群中最常見的一種異構，故常稱為野生型，而ε2、ε4稱為變異型，從而形成6 種不同表型:3 種純合子(ε2/2、ε3/3、ε4/4)和3種雜合子(ε2/3、ε3/4、ε2/4)。攜帶不同 ApoE 基因型的個體其血脂水平有差異，從而影響與血脂水平相關疾病的發病率〔6〕。在不同國家和地區人群中ApoE 6種基因型的分布不均勻，有明顯的共同特點，即:ε3/3型發生頻率最高;含ε3等位基因的雜合子(ε4/3，ε3/2)次之;ε2/2、ε4/4、ε4/2 的發生頻率最低。本研究結果顯示:在北京市社區老年人群中，老年健康對照組 ApoE 基因型頻率分別為 ε3/3，72.0%;ε4/3，12.0%;ε3/2，14.0%;ε2/2，0%;ε4/4，0%;ε4/2，2.0%;ε4 等位基因頻率為7.0%，符合上述規律。與馬鳳等〔7〕報告的2 000例中國農村地區65歲及以上老年人群ApoE基因型頻率及ε4等位基因頻率分布 (ε3/3，68.8%;ε4/3，13.3%;ε3/2，13.6%;ε2/2，1.1%;ε4/4，1.2%;ε4/2，2.0%;ε4，8.8%)相近。ε4 等位基因頻率亦接近于香港的7.4%;略高于臺灣的4.9%和新加坡的6.4%;低于大多數歐洲及北美人群。

PAOD和EH的共同病理基礎主要是動脈粥樣硬化。李小鷹等〔8〕對北京社區2 124例60歲及60歲以上老年人的流行病學調查資料表明，PAOD在北京地區老年人群中的現患率為15.91%;在老年血脂異常患者中為17.18%;在老年血脂異常合并高血壓患者中為19.18%;在老年血脂異常合并糖尿病患者中為19.48%;在高齡血脂異常患者中為42.86%;高齡血脂異常患者PAOD的現患率是普通老年患者的2～3倍。由此說明導致PAOD病理改變的因素中血脂異常與高齡起了關鍵的作用，高血壓、糖尿病亦是促進PAOD病理改變的不容忽視的因素。PAOD、高血壓均為老年常見病，其發生發展與吸煙、飲酒、高鹽高脂飲食、肥胖、精神緊張和情緒變化等多種外界因素相關，遺傳因素在其發病中也起著重要作用〔4〕。ApoE是調節機體脂質代謝的重要因素，有關ApoE基因多態性與PAOD的易感性研究在國內外尚未見報道。為了避免因病例選擇造成的偏倚，本研究選擇的病例及對照組均為中國北方漢族人、居住同一社區、無血脂異常、繼發性高血壓、糖尿病、血管梗死性疾病，盡可能減少這些因素的影響。本研究通過對EH、PAOD、EH+PAOD老年病例組與NC組ApoE基因多態性的分析發現，盡管ε4等位基因頻率三個病例組均高于NC組，ε3和ε2等位基因頻率均低于NC組，但是無統計學意義。從而表明，在本研究人群中，ApoE等位基因ε4、ε3和ε2多態性不是老年EH和老年PAOD的獨立危險因素，可能與血脂正常的老年EH和老年PAOD發生無關，即血脂正常的老年人群中EH與PAOD的發生還有其他影響因素的參與。Yilmaz等〔9〕報道ApoE等位基因ε4與EH相關，與本研究結論不一致，可能與其病例組的選擇不都是血脂正常的老年人有關。總之，進一步研究遺傳易感因素在老年EH和老年PAOD發病中的貢獻，有助于減少該病在老年人群中的發病率改善人們的生活質量。

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3 Yang YG，Kim JY，Park S，et al.Apolipoprotein E genotyping by multiplex tetra-primer amplification refractory mutation system PCR in single reaction tube〔J〕.J Biotechnol，2007;131(2):106-10.

4 Smith FB，Lee AJ，Rumley A，et al.Tissue-plasminogen activator，plasminogen activator inhibitor and risk of peripheral arterial disease〔J〕.Atherosclerosis，1995;115(1):35-43.

5 Utermann G，Vogenberg KH，Steinmetz A，et al.Polymorphism of apolipoprotein E genetics of hyperlipoprotypeinemia type Ⅲ〔J〕.Clin Genet，1979;15(1):37-62.

6 Rastas S，Mattila K，Verkkoniemi A，et al.Association of apolipoprotein E genotypes，blood pressure，blood lipids and ECG abnormalities in a general population aged 85〔J〕.BMC Gefiatr，2004;4:1.

7 馬 鳳，梁超軻，程義斌，等.中國農村老年人群APOE基因型頻率分布研究〔J〕.環境與健康雜志，2008;25(8):662-4.

8 李小鷹，王 潔，王全義，等.周圍動脈硬化閉塞癥在老年血脂異常人群中的現患率調查〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2005;7(1):3-6.

9 Yilmaz H，Isbir T，Agachan B，et al.Is epsilon 4 allele of apolipoprotein E associated with more severe end-organ damage in essential hypertension〔J〕.Cell Biochem Funct，2001;19(3):191-5.