無動物成分器官培養法保存角膜內皮細胞活性的實驗研究

魏 捷，蔣 華

器官培養保存法是目前國際上主要的角膜供體長期保存法，能保持角膜內皮細胞（corneal endothelial cells，CEC）活性長達 4周，不僅利于合理配置角膜資源，而且角膜抗原性也會隨保存時間延長而逐漸減弱。研究認為，保存至3周時角膜片內的樹突狀細胞可完全消失[1]，可以降低免疫排斥反應發生率。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）因為營養成分豐富在器官培養保存法中應用廣泛，但其批間變異大，成分不夠清晰穩定，還有病原體污染風險。出于對人體安全性的長遠考慮，有必要考慮自培養基中去除血清成分[2]。本實驗擬對新型培養基－無動物成分培養基 （animal compound free medium，ACF）在無血清器官培養保存CEC活性方面的效果進行初步探索。

1 材料和方法

1.1 材料與動物分組 16只SPF級成年Wistar大鼠，體重200～250 g，雌雄不限，山東大學動物實驗中心提供，過量麻醉處死，取雙側眼球。ACF購自美國Sciencell公司，MEM購自美國Gibco公司，葡聚糖T-500購自美國Pharmacia公司，兔多克隆抗ZO-1抗體購自Santa Cruz公司，SP-9000免疫組化染色試劑盒來自北京中杉金橋生物技術有限公司，RNA裂解液、總RNA提取試劑盒購自上海華美生物工程公司，TaKaRa試劑盒及DNA Marker由大連寶生物公司提供，引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。將角膜片隨機分為2組，每組16只。對照組：角膜保存于MEM+2%FBS培養液中。試驗組：即ACF組，角膜保存于無血清的ACF培養液中。

1.2 角膜器官培養保存方法 在超凈臺上按眼庫標準無菌化程序處理。生理鹽水沖洗眼球，再依序浸泡于0.5%碘伏溶液和含500 U/ml慶大霉素的乳酸林格液中，時間分別為2、20 min。剪下完整角膜片，角鞏膜緣縫合1針后懸吊于20 ml培養液中，密封保存瓶口，置于31℃恒溫箱中不換液保存4周。保存結束后，將角膜移至10 ml脫水液（各組培養液中加5%葡聚糖T500）中，31℃恒溫脫水48 h。

1.3 保存前后ECD計數 保存前大鼠角膜置于培養皿中，0.9%生理鹽水浸泡4 min，使細胞間隙暫時擴大，倒置顯微鏡下計數角膜內皮細胞密度（endothelial cells density，ECD）。 保存結束脫水后，大鼠角膜內皮面滴0.25%臺盼藍染色1 min，生理鹽水緩慢漂洗，再滴1%茜素紅染色2 min，生理鹽水漂洗，普通光學顯微鏡下計數角膜ECD。

1.4 免疫組織化學染色法檢測內皮層中ZO-1的表達 保存結束取出大鼠角膜，立即OCT包埋，液氮內速凍15 min，轉入深低溫冰箱保存備用。檢測時連續冰凍切片，厚度4 μm，常規貼片、固定，晾干，密封，4℃短期保存。染色當天取出玻片，按說明書行SP三步法免疫組織化學染色，風干，封片，觀察照相。兔多克隆抗ZO-1抗體按1∶200濃度稀釋。

1.5 RT-PCR檢測去上皮角膜中ZO-1mRNA表達每組取6只保存后大鼠角膜，去除上皮層，按照TRIzol試劑盒說明書進行總RNA的提取，逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。ZO-1(249bP)的上游引物：5’-GCCTCTGCAGTTAAGCAT-3’，下游引物：5’-AAGAGCTGGCTGTTTTAA-3’。 β-actin(281bP)的上游引物：5'-TGACGAGGCCCAGAGCAAGA-3'，下游引物：5'-ATGGGCACAGTGTGGGTGAC-3'。 PCR擴增條件：94℃預變性5 min，反應35個循環，其中94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循環結束后72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳100 min，凝膠紫外成像系統中掃描拍照并分析，

以目的基因的擴增帶灰度與同管擴增的β-actin擴增帶灰度之比來表示目的基因的mRNA表達水平。1.6 統計學分析 采用SPSS 15.0統計分析軟件進行統計學處理，數據先求出組內x±s，顯著性分析用t檢驗。

表1 保存前后各組大鼠角膜內皮細胞密度（個/mm2，x±s)

2 結果

2.1 培養保存過程中角膜的大體圖像 自培養后第2天，兩組角膜出現漸進性加重的基質水腫，上皮灰白色混濁，中央出現片狀剝離。此后，角膜水腫逐漸加重，基質明顯增厚，內皮面出現皺褶并逐漸增多。多數角膜在保存7～10 d時厚度達峰值。在葡聚糖T500中脫水48 h后，角膜變薄并基本恢復透明。

2.2 保存前后CEC計數 保存前兩組間角膜ECD無統計學差異（P＞0.05）。保存結束并脫水2 d后，對照組ECD大幅下降，而ACF組的ECD則高于2000個/mm2，組間比較有統計學差異（P＜0.01）。計算 28 d保存期內日均CEC丟失率 [(保存前ECD－保存后ECD)／保存前ECD×100%÷28]衡量CEC損失程度，發現ACF組明顯低于對照組，兩組間比較有統計學差異（P＜0.01）。脫水結束后，活性染色顯示ACF組中CEC死亡比例明顯低于對照組，組間比較差異非常顯著（P＜0.01）。 見表 1。

2.3 免疫組織化學染色結果 冰凍切片顯示ZO-1在大鼠角膜內皮面有明確表達，呈棕黃色顆粒，廣泛分布于胞漿內（圖1）。ACF組切片上CEC與后彈力層貼附較緊密，ZO-1即隨內皮細胞呈連續線形表達，表達強度高；對照組CEC間連接相對松散，有部分細胞脫落或不表達，ZO-1表達強度相對降低。

①對照（MEM+20 ml/L FBS)組 ②ACF 組圖 1 保存后大鼠角膜內皮層中ZO-1的表達（SABC ×400）

2.4 RT-PCR半定量檢測去上皮大鼠角膜中ZO-1mRNA的表達 結果顯示兩組大鼠角膜都有ZO-1mRNA表達，大小249 bp，與目的基因長度一致（圖 2）。ACF組 ZO-1mRNA表達水平 （0.921 8±0.027 0）明顯高于對照組（0.452 7±0.012 7），組間比較有非常顯著性差異（t=38.448，P=0.000）。

圖 2 RT-PCR檢測去上皮大鼠角膜中ZO-1mRNA表達的電泳圖

3 討論

要實現角膜植片無血清器官培養方式，前提是尋找到營養成分更為豐富的替代培養基。近年來，一些特殊設計無血清培養基相繼問世，而被稱作“chemical defined”（CD，限定化學成分的）的無動物來源培養基的出現，標志著細胞培養基發展的更高境界，徹底消除了培養基生物安全方面的擔憂。目前國外學者在該領域的研究結論多傾向于選擇endothelial SFM[3，4]，一種原設計支持人臍靜脈和臍動脈內皮細胞分離、生長的特殊培養基。它對CEC的保存效果確切，但價格昂貴，不是推廣應用的最佳選擇。因此，本實驗選擇研究成本相對較低的ACF。

Slettedal等[4]研究證實，即使在人角膜，在器官保存損傷過程中，CEC也會啟動修復程序，具體修復機制不僅有擴大移行，還包括增殖分裂過程。而ACF中富含多種對于啟動和促進CEC的增殖修復都非常關鍵的生長因子和種類豐富的其他營養成分，可以更好地發揮內皮保護作用[5]。本實驗結果顯示，保存結束后，MEM＋2%FBS組的ECD值降至2000個/mm2以下，證明這種“基礎”培養基的營養成分不足以充分滿足不換液狀態下CEC的長期生存需要。相比之下，無血清的ACF組不僅最終ECD值要高出許多，達到（2 143±169）個/mm2，還同時擁有較低的細胞日均損失率和死亡細胞比例。在眼庫工作中，角膜ECD值是評價保存后植片質量的最重要指標，多要求在2 000～2 200個/mm2以上，ACF組的保存結果完全滿足該項要求，進一步證明無血清ACF可以較傳統MEM培養基更好地保存CEC活性，滿足移植手術的需要。

細胞間緊密連接在維持內皮細胞屏障功能上發揮著重要作用[6]。ZO-1是一種磷酸蛋白，蛋白家族膜相關鳥苷酸激酶的家族成員，分子量220 000，屬結構性跨膜蛋白，是構成上皮和內皮細胞間緊密連接的重要成分之一，到目前為止還沒有發現缺乏ZO-1的緊密連接。若是ZO-1表達水平下降或缺失，多數情況下存在緊密連接的組織結構如血腦屏障、視網膜色素上皮細胞間、角膜內皮細胞間等會隨之松散甚至分解，所以ZO-1常被用作緊密連接的屏障功能和通透性功能的衡量指標[7，8]。現有ZO-1抗體只可用于人或鼠，因此，筆者選用大鼠角膜來做檢測。病理切片發現ZO-1的確存在于保存后大鼠CEC層。不過大鼠角膜小且后彈力層菲薄撕除難度大，而ZO-1在基質中又少有表達，所以半定量RT-PCR法改為檢測去上皮后大鼠角膜中ZO-1的表達，結果與CEC的計數資料趨勢保持一致，ZO-1在ACF保存組的表達水平明顯高于MEM組，檢測ZO-1的表達可在一定程度上輔助反映CEC的功能狀態和細胞間緊密連接的完整性，也從另一個側面證實了ACF能有效保持CEC活性的良好效果。

綜上所述，自器官培養基中除去血清成分是組織細胞培養發展過程中的新要求和必然趨勢。ACF營養豐富，能有效降低密閉保存過程中CEC的損失程度，成分明確，便于進行對比研究，還可以排除病原體傳染風險，對CEC的保護作用明顯超越傳統的MEM，在無血清器官培養保存CEC活性方面極有發展潛力。

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