高效液相色譜法測定女貞子中齊墩果酸的含量

彭婷婷 王衛華 菏澤醫學專科學校，山東省菏澤市 274000

女貞子為木犀科植物女貞（ligustrum lucidumait.）的干燥成熟果實，味甘、苦，性涼，具有補肝腎陰，烏須明目的功效［1］。現代醫學研究認為女貞子可以抑制幽門螺桿菌的作用可以治療胃病，還具有抑制嘌呤異常代謝用于痛風和高尿酸血癥的治療。主要用于治療肝腎陰虛，腰酸耳鳴，須發早白；眼目昏暗，視物昏暗；陰虛發熱，胃病及痛風和高尿酸血癥［2］。藥理研究表明女貞子中促進免疫的主要有效成分為齊墩果酸、熊果酸及乙酰齊墩果酸［3］。齊墩果酸屬五環三萜類化合物，是一種光譜抗變態反應藥，也是一種良好的免疫調節劑［4］。有文獻記載采用薄層色譜法測定女貞子中齊墩果酸的含量［5］。本文建立高效液相色譜法（HPLC）測定女貞子中齊墩果酸含量，為合理提取女貞子的活性成分及女貞子的進一步開發利用提供理論依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（標準二元泵，標準自動進樣器，紫外檢測器，安捷倫Chem Station工作站），Phenomenix Luna C18柱（4.6×250mm，5μm）；紫外可見光分光光度計：TU－1810，北京普析通用儀器有限責任公司，Mettler Toledo AL 104電子分析天平；Mettler Toledo 320－S p H計；微孔濾膜（0.45μm，北洋膜技術公司），超聲清洗儀（上海之信儀器有限公司），速微型離心機（北京醫用離心機廠）。

1.2 試劑 齊墩果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110709－200304）；女貞子購自于菏澤市牡丹大藥房，批號分別為100830，100905，100910，100916，甲醇為色譜純，水為蒸餾水，超純水，其他試劑、試藥均為分析純。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的齊墩果酸對照品10mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得濃度1mg／ml的齊墩果酸對照品溶液。

2.2 齊墩果酸樣品溶液的制備

2.2.1 女貞子中齊墩果酸的提取。取女貞子粗粉2g，放入100圓底燒瓶中，加15%鹽酸20ml，再加三氯甲烷20ml，于70℃水浴加熱回流2h，過濾，取三氯甲烷提取液回收至糖漿狀，趁熱轉移至燒杯中，冷后成半固體狀。

2.2.2 齊墩果酸的精制。取上述半固狀物，以少量石油醚洗滌，除去脂溶性較大的成分，即有固體析出，抽干得淺黃色析出物。稱重用1∶100倍量（W／V）95%乙醇回流10min，過濾，濾液濃縮至小體積，放置，析出粗晶，抽濾得齊墩果酸粗品。反復用95%乙醇重結晶，得到精制得齊墩果酸固體，經稱重為120mg。

2.2.3 齊墩果酸樣品液的制備。取精制所得的齊墩果酸樣品40mg，放入100ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲溶解，過濾，取濾液10ml放入100ml容量瓶中，再用甲醇稀釋至刻度，即得齊墩果酸樣品溶液。

2.3 色譜條件及系統適用性實驗 色譜柱：Phenomenix Luna C18柱（4.6×250mm，5μm）；流動相為甲醇∶水∶冰乙酸（265∶35∶0.1，V／V），流速為0.8ml／min，檢測波長為210nm，進樣量20μl。取齊墩果酸對照品溶液和女貞子中提取的齊墩果酸樣品溶液分別進樣測定，記錄色譜圖，結果樣品溶液和對照品溶液在相同保留時間處有吸收峰，見圖1。

圖1 齊墩果酸高效液相色譜圖

3 實驗結果

3.1 線性關系的考察 取對照品溶液適量，用流動相稀釋得到5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml、25μg／ml、40μg／ml、60μg／ml的溶液，然后按照2.3項下的條件進樣20μl進行測定，并且各測定3次，記錄峰面積。以進樣量（X）與對應的峰面積（Y）作回歸處理，得標準曲線，Y＝4.895 2X＋0.207 3（r＝0.999 8）。結果表明，齊墩果酸對照品在5～60μg／ml濃度范圍內進樣量與峰面積間均呈良好的線性關系，見表1、圖2。

表1 濃度與色譜峰面積關系

圖2 齊墩果酸標準曲線

3.2 精密度實驗 精密吸取20μL齊墩果酸對照品溶液，注入液相色譜儀，按2.3項下色譜條件，連續重復進樣6次，峰面積的平均值為4 922。結果表明女貞子中齊墩果酸的RSD為1.34%，表明本法精密度良好，見表2。

表2 精密度試驗結果

3.3 穩定性試驗 取女貞子藥材粉末2g，精密稱定，按2.2項下供試品溶液制備方法制備供試品，分別于0、2、4、8、12、24h分別精密吸取20μL，測定峰面積值，得峰面積平均值147.5，RSD＝1.93%（n＝6），可見供試品溶液在24h內，穩定性良好。

3.4 重現性試驗 稱取同一批女貞子粉末6份，按2.2項下方法，制備供試液，分別精密吸取20μL，注入液相色譜儀，進行定量測定，得峰面積平均值145.4，其RSD值為0.95%，表明利用本法測定女貞子中齊墩果酸的含量、方法重現性良好。

3.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的女貞子粗粉9份，分別加入25μg／ml對照品溶液1ml，2ml，3ml，按2.2項下方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液20μL，注入液相色譜儀，進行定量測定，計算加樣回收率。結果女貞子齊墩果酸的平均加樣回收率為100.64%，RSD為1.46%。具體結果見表3。

表3 回收率試驗結果（n＝9）

3.6 樣品測定 分別取上述女貞子藥材樣品，按2.2項下方法，制備供試液，分別精密吸取20L，注入液相色譜儀，按上述色譜條件，分別測定樣品中齊墩果酸的含量，測定結果見表4。

表4 女貞子中齊墩果酸的含量（%）

4 討論

（1）測定波長的選擇：采用紫外分光光度計在190～380nm范圍內分別掃描齊墩果酸對照品、供試品溶液中齊墩果酸峰的紫外吸收，對照品和供試品中的齊墩果酸均在210nm有最大吸收，故選用210nm作為測定波長。（2）女貞子中齊墩果酸的提取：根據女貞子中齊墩果酸以游離型和結合成苷的形式共存于果實中，采用兩相溶劑水解法［6］提取女貞子中的齊墩果酸。即讓女貞子中的齊墩果酸苷在鹽酸水溶液中水解，同時在反應混合物中加入與水不相混溶的有機溶劑（如苯、三氯甲烷），使水解后的齊墩果酸苷元即刻進入有機相，可避免苷元長時間和酸接觸，從而得到原始的苷元。（3）由表4可以看出，100830、100905、100910、100916批次的女貞子中齊墩果酸的含量分別為5.75%，4.93%，4.14%，3.85%，隨著采收日期的推遲，女貞子中齊墩果酸的含量呈下降趨勢，符合文獻中對于女貞子中齊墩果酸的含量的描述。文獻記載［7］，女貞子中齊墩果酸的含量以幼果期（8月份）含量最高，可達8.04%，隨著發育成熟下降到2.5%左右。（4）本文是首次采用高效液相色譜外標法測定女貞子中齊墩果酸的含量。有文獻［8］記載采用薄層色譜法測定女貞子中齊墩果酸的含量。與薄層色譜法相比，高效液相色譜外標法靈敏度更高，專屬性更強，結果更準確，而且適合大量樣品的分析。本方法的線性回歸曲線方程為：Y＝4.895 2X＋0.207 3，r＝0.999 8（n＝6），在5～60μg／ml范圍內呈良好線性關系，符合利用外標法進行定量計算的要求。本方法的精密度、穩定性、重現性均符合要求。此外，本方法的平均加樣回收率為100.64%，RSD%為1.46%，表明方法的準確度符合定量分析方法的要求。

［1］ 周志勇，袁丁.齊墩果酸藥理作用研究進展〔J〕.中國醫院藥學雜志，2008，28（23）：2031.

［2］ 郭立忠，張悅 .女貞子的化學成分及藥理作用〔J〕.長春中醫藥大學學報，2008，24（6）：662.

［3］ 董娟娥，張靖 .植物中環烯醚萜類化合物研究進展〔J〕.西北林學院學報，2004，19（3）：131.

［4］ 潘杭君，孫紅祥 .三萜皂苷的免疫調節作用〔J〕.中國獸醫學雜志，2003，1：42.

［5］ Wren SAC.Peak capacity in gradient ultra performance liquid chromatography（UPLC）〔J〕.J Pharm Biomed Anal，2005，38（2）：337.

［6］ 郭娜，馬芳，范斌 .超高效液相色譜法測定女貞子不同炮制品中女貞苷含量〔J〕.中國中醫基礎醫學雜志，2010，16（12）：1171－1172.

［7］ Castr－Perez J，PlumbR，Granger JH，et al.Increasing throughput and information content for in vitro drug metabolism experiments sing ultra－performance liquid chromatography coupled to a quadrllpole time－of－light mass spectrometer〔J〕.Rapid Commun in Mass Spectrom，2005，19（6）：843.

［8］ 李陽，孫文基 .女貞子中2種主要裂環環烯醚萜苷類成分的含量考察〔J〕.中國中藥雜志，2008，18（33）：2099.