腎癌中KISS-1與E-cadherin的表達及調控關系

張輝，宋永勝，吳斌

（中國醫科大學附屬盛京醫院泌尿外科，沈陽 110001）

腎癌是泌尿系中最常見的惡性腫瘤之一，僅次于膀胱腫瘤，約占腎臟惡性腫瘤的85%。既往腎癌就診時20%～35%已有轉移，6%～15%是因為轉移癥狀而就診［1］，因此加強對腎癌轉移的分子機制的研究尤為重要。KISS-1基因是一個重要的腫瘤轉移抑制基因，能明顯抑制腫瘤細胞的化學趨向性和侵襲性，并限制腫瘤細胞的遷移、蠕動功能［2］。本研究擬應用實時PCR檢測KISS-1基因和上皮細胞鈣粘蛋白（epithelia cadherin，E-cadherin）在腎癌中的表達，并研究KISS-1對腎癌細胞Caki-1中E-cadherin的調控作用。

網絡出版時間：2011-09-26 12:08

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

所有組織標本均來源于2007-2010年中國醫科大學附屬盛京醫院泌尿外科患者，包括53例原發未轉移腎癌和46例原發伴轉移腎癌。患者年齡47～63歲，行經腹腔根治性腎切除術，經病理診斷證實為腎透明細胞癌，均未接受放療和化療。組織標本切除后浸入RNAlater，放入-80℃冰箱中保存。人腎癌細胞系Caki-1為本實驗室保存；重組真核表達載體pIRES2-KISS1為本實驗室前期研究構建?？俁NA抽提試劑TRIZOL和轉染試劑Lipofectamin 2000購自Invitrogen公司，大腸埃希菌DH5α、逆轉錄試劑盒和實時PCR試劑盒購自TaKaRa公司，無內毒素質粒中提試劑盒購自北京天根公司，抗KISS-1和E-cadherin抗體購自Abcam公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中山公司，Western blot相關試劑購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 實時PCR：TRIZOL法提取總RNA，逆轉錄成cDNA。以β-actin為內參基因，按照試劑盒說明書擴增KISS-1和 E-cadherin基因，KISS-1上游引物：5′-TTCCTCTGTGCCACCCACTT-3′， 下 游 引 物 ：5′-GCAGTAGCAGCTGGCTTCCT-3′；E-cadherin 上游引物：5′-GCTTCCCTCTTTCATCTCCT-3′，下游引物：5′-TAGTTCCGCTCTGTCTTTGG-3′。應用 ABI公司的7500 Real-time PCR儀，7500 Software v2.0軟件。實驗獲得數據采用比較CT值法（2-ΔΔCT法）進行相對定量分析。計算公式：（1）改變的倍數＝2-ΔΔCT；（2）ΔΔCT＝ΔCT腫瘤組-ΔCT癌旁組；（3）ΔCT＝CT靶基因-CT內參。結果為相對于對照組實驗組中靶基因的表達相對于內參的改變倍數。

1.2.2 提取無內毒素重組載體：將表達載體pIRES2-KISS-1轉化大腸埃希菌DH5α，接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，收集菌液，采用無內毒素質粒中提試劑盒，按照說明書抽提無內毒素重組載體。

1.2.3 載體轉染：Caki-1細胞以5×104/孔轉種于6孔培養板中，培養至細胞80%～90%融合。按轉染試劑說明書進行轉染，繼續培養48 h后收集細胞進行Western blot檢測。

1.2.4 Western blot：未轉染的Caki-1細胞為空白對照組，轉染pIRES2的Caki-1細胞為陰性對照組，轉染pIRES2-KISS1的Caki-1細胞為實驗組。提取待測細胞蛋白，定量，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后將PVDF膜先后與一抗和二抗孵育，與ECL發光底物結合后顯影、成像。經GDS凝膠成像分析系統進行光密度分析，目的條帶的光密度與內參蛋白β-actin的光密度的比值即為目的蛋白表達的相對值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 實時PCR檢測腎癌組織中KISS-1和E-cadherin mRNA的表達

通過引物溶解曲線分析，KISS-1基因擴增成功。結果顯示，KISS-1mRNA在原發未轉移腎癌和原發伴轉移腎癌組織中的△CT分別為4.372±0.518與 5.841±0.487，ΔΔCT為 1.469，伴轉移組中 KISS-1 mRNA較未轉移組明顯下調，為未轉移組表達量的36.1%，差異有統計學意義（P<0.05）。而E-cadherin mRNA 的△CT分別為 3.647±0.438與 4.904±0.548，ΔΔCT為 1.257，E-cadherinmRNA 在伴轉移組中表達明顯下調，為未轉移組表達量的41.8%，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 KISS-1和E-cadherin的相關性分析

通過Pearson相關分析，KISS-1和E-cadherin的表達水平呈負相關（r=-0.735，P<0.05）。

2.3 Western blot檢測 RNA干擾Caki-1細胞中KISS-1和E-cadherin蛋白的表達

空白對照組、陰性對照組和實驗組細胞中KISS-1蛋白的相對表達分別為0.473±0.052、0.446±0.048和1.138±0.074，E-cadherin蛋白的相對表達分別為 0.564±0.061、0.587±0.068 和 1.263±0.087（圖1）。與空白和陰性對照組相比，實驗組細胞中KISS-1和E-cadherin蛋白的表達均明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

KISS-1基因是由Lee等［3］在人類黑色素細胞株中發現的一種腫瘤轉移抑制基因，定位于染色體1q32-q41。KISS-1基因能明顯抑制腫瘤細胞的化學趨向性和侵襲性，并限制腫瘤細胞的遷移蠕動功能［2］。KISS-1基因在乳腺癌和胃癌等多種腫瘤中存在轉移抑制作用［4，5］。最新的研究表明，KISS-1 基因高表達在膽囊癌和胰腺癌患者中均有較好的預后［6，7］。本研究應用實時PCR檢測發現，與原發未轉移腎癌相比，KISS-1mRNA在原發伴轉移腎癌組織中的表達明顯下調。KISS-1基因與腎癌的轉移相關，可能在腎癌的轉移過程中發揮抑制作用。我們前期的細胞水平研究發現，沉默腎癌769-P細胞中KISS-1基因的表達能夠增強769-P細胞的侵襲能力［8］。因此，研究證實KISS-1基因在腎癌中具有抑制腫瘤細胞侵襲轉移的功能。

E-cadherin屬于鈣粘蛋白家族，它廣泛存在于各類上皮細胞中，通過胞漿連環蛋白與細胞骨架蛋白相連，是介導細胞之間以及細胞與細胞外基質粘附的主要分子之一［9］。有研究報道，E-cadherin由于啟動子區甲基化等原因造成的表達下調，與多種腫瘤的轉移相關［10，11］。本研究發現，與原發未轉移腎癌相比，E-cadherinmRNA在原發伴轉移腎癌組織中的表達明顯升高。E-cadherin基因與腎癌的轉移相關。進一步的統計分析顯示，在全部的腎癌組織中KISS-1和E-cadherin的表達呈正相關，二者之間可能有內在的調控關系。

我們將表達載體pIRES2-KISS1轉染腎癌Caki-1細胞，上調其中KISS-1蛋白的表達，Western blot檢測證實E-cadherin蛋白顯著上調。腎癌細胞中KISS-1和E-cadherin存在正性調控的關系，KISS-1的表達改變能夠影響E-cadherin的表達。綜上所述，我們認為KISS-1基因能夠通過上調E-cadherin的表達發揮其腫瘤轉移抑制基因的作用，進一步的深入探討將為研究腎癌的轉移機制提供新的理論依據，而且能夠為腎癌的治療提供新靶點。

［1］葛宏發，李慎勤.泌尿外科疾病診斷和鑒別診斷［M］.2版.北京：人民衛生出版社，2001：199.

［2］West A，Vojta PJ，Welch DR，et al.Chromosome localization and genomic structure of the KISS-1 metastasis suppressor gene（KISS1）［J］.Genomics，1998，54（1）：145-148.

［3］Lee JH，Miele ME，Hicks DJ，et al.KISS-1 a novel human malignant melanoma metastasis suppressor gene［J］.J Natl Cancer Inst，1996，88（23）：1731-1737.

［4］Mitchell DC，Abdelrahim M，Weng J，et al.Regulation of KISS-1 metastasis suppressor gene expression in breast cancer cells by direct interaction of transcription factors activator protein-alpha and specificity protein-1［J］.J Biol Chem，2006，281（1）：51-58.

［5］Dhar DK，Naora H，Kubota H，et al.Downregulation of KISS-1 expression is responsible for tumor invasion and worse prognosis in gastric carcinoma［J］.Int J Cancer，2004，111（6）：8868-8872.

［6］Sanchez-Carbayo M，Capodieci P，Cordon-Cardo C.Tumor suppressor role of KISS-1 in bladder cancer：loss of KISS-1 expression is associated with bladder cancer progression and clinical outcome［J］.Am J Pathol，2003，162（2）：609-617.

［7］Katagiri F，Nagai K，Kida A，et al.Clinical significance of plasma metastin level in pancreatic cancer patients［J］.Oncol Rep，2009，21（3）：815-819.

［8］張輝，趙丹懿，宋永勝.KISS-1基因在腎癌中的表達及對細胞侵襲力的影響［J］.中國醫科大學學報，2007，36（2）：171-172.

［9］Kokkinos MI，Murthi P，Wafai R，et al.Cadherins in the human placenta-epithelial-mesenchymal transition（EMT）and placental development［J］.Placenta，2010，31（9）：747-755.

［10］Derksen PW，Braumuller TM，van der Burg E，et al.Mammaryspecific inactivation of E-cadherin and p53 impairs functional gland development and leads to pleomorphic invasive lobular carcinoma in mice［J］.Dis Model Mech，2011，4（3）：347-358.

［11］Chou CH，Lieu AS，Wu CH，et al.Differential expression of hedgehog signaling components and Snail/E-cadherin in human brain tumors［J］.Oncol Rep，2010，24（5）：1225-1232.