腎透明細胞癌組織中組蛋白乙?；竓MOF的表達及其乙酰化位點的初步研究

蘆志華，王勇，遲長亮，3，唐宇哲，3，蔡勇，金景姬，王春喜

（1.吉林大學第一醫院泌尿外科，長春 13002；2.吉林省人民醫院泌尿外科，長春 130021；3.吉林大學研究生院，長春 130012；4.吉林大學生命科學學院，長春 130012）

組蛋白乙?；揎椩诨蜣D錄調控、DNA損傷修復及細胞周期調控等生物學過程中發揮重要作用。組蛋白乙酰化狀態的異常與多種疾病有關［1］。組蛋白乙?；揎椡ǔ０l生在H3、H4亞單位上，其中60%的H4呈單乙?；癄顟B，且多數發生在H4組蛋白N端第16位賴氨酸（K16），即H4K16Ac。目前已知hMOF基因調控H4K16的乙?；?，其缺失將可能導致整個基因組范圍內的H4K16Ac減少。另有研究表明，在人體內hMOF的乙?；稽c可能并不僅僅局限于H4K16［2］。目前尚無hMOF基因在腎透明細胞癌（以下簡稱腎癌）組織中的表達情況及乙酰化位點的報道。本研究擬探討腎組織中hMOF基因及蛋白的表達情況，及H4K5、K8、K16位點乙?；脚chMOF基因表達水平之間的關系，從而進一步明確腎癌的發病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

選取我院2008-2010年腎透明細胞癌組織病理切片66例，并以癌旁正常腎組織為對照。匯總患者相關臨床資料（年齡、性別、腫瘤最大徑、Fuhrman分級、pT分期、局部復發、淋巴結及遠處器官轉移等）。所有患者均為原發性腎癌，術前均未行放、化療及靶向藥物治療。收集近期我院行腎癌根治術的腎癌組織樣本9例，其中Fuhrman分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級各3例，并留取癌旁正常腎組織作為對照。收集樣本后立即以液氮凍存。采用Biozol RNA試劑盒（Biomiga公司）1批次提取組織總RNA，用superRT cDNA試劑盒（CWbio公司）將其逆轉錄成cDNA，-20℃保存。

ABI PRISM 7300熒光實時定量 PCR（qRTPCR）儀 （Applied Biosystems，美國），SYBR Green Mix（ABgene，英國）。hMOF蛋白一抗（Bethyl公司，產品編號：IHC-00497），H4K5、H4K8、H4K16 乙?；囊豢梗║pstate公司，產品編號依次為07-327/07-328/07-329），一抗稀釋比例均為1︰250。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR：提取9例腎癌（Fuhrman分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3例）及癌旁正常腎組織共18例標本的總RNA進行qRT-PCR分析。以GAPDH為內參來對hMOFmRNA的表達水平進行標準化。設計hMOF基因熒光 Real-time PCR 上游引物：5′-GAAGTCACGGTGGAGATCGGA-3′，下游引物：5′-CTTGGCCAGCAGACACAGGTT-3′，由上海生工生物技術公司負責合成，產物長度為170 bp。以人GAPDH基因為內參，上游引物：5′-ATGGGTCAGAAGGATTCC TATGT-3′，下游引物：5′-AGCCACACGCAGCTCATT-3′，產物長度400 bp。每例腎癌及癌旁正常腎組織的總RNA樣本取3份，人GAPDH基因內參2份，空白對照2份。共58份。qRT-PCR體系如下：SYBR Green 12.5 μL、dH2O 4.5 μL、上、下游引物各 2 μL（濃度 2 mmol/L）、cDNA 模板 4 μL（濃度 2 ng/μL）。40個循環。實驗數據的標準化采用ΔΔCt法。

1.2.2 免疫組化：采用標準的免疫組化流程進行操作。組織抗原修復方式：放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）內，高壓煮沸1 min。染色結果的評判：hMOF蛋白、H4K5、K8、K16Ac均定位于細胞核內。采用2級計分法：陽性細胞數＜5%，5%～24%，25%～50%，51%～74%及≥75%，分別判定為 0、1、2、3、4 分；每張切片陽性細胞的著色強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別判定為0、1、2、3分；根據2項積分之和判定結果：0分為陰性（-），1～3分為弱陽性（+），4～5分為中等陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。每例均設有HE切片作對照觀察，并設陽性和陰性對照。計分過程由2位病理醫師分別完成。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0統計學軟件完成多組資料的單向方差分析以及Fisher檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腎癌組織中hMOFmRNA表達水平的研究

qRT-PCR結果（圖1）顯示：9例腎癌組織中，4例（44.4%）hMOFmRNA表達水平較其癌旁正常腎組織下降2倍以上（即log2＜-1），其中FuhrmanⅡ級1例，FuhrmanⅢ級3例。

2.2 腎癌組織中hMOF蛋白的表達水平

免疫組化染色結果（圖2）顯示：66例腎癌組織切片中，26例（39.4%）hMOF蛋白的綜合免疫組化評分≤3分（即陰性和弱陽性），其中FuhrmanⅠ級2例（7.7%，2/26），Ⅱ級 6例（23.1%，6/26），Ⅲ級 18例（69.2%，18/26）。

2.3 腎癌組織中H4K5、H4K8、H4K16的乙?；?/h3>

免疫組化染色結果（圖3）顯示：在上述26例hMOF蛋白表達下降的腎癌組織切片中，20例H4K5、H4K8乙?；C合免疫組化評分≤3分（76.9%），其中 FuhrmanⅡ級 4例（20.0%，4/20），Ⅲ級16例（80.0%，16/20）。23例（88.5%）H4K16乙酰化免疫組化評分≤3分，其中FuhrmanⅡ級5例（21.7%，5/23），Ⅲ級 18 例（78.3%，18/23）。H4K5、H4K8、H4K16乙酰化水平與hMOF蛋白的表達水平具有相同的變化趨勢：hMOF蛋白表達水平降低，H4K5、H4K8、H4K16乙?；揭嘟档汀?/p>

2.4 hMOF蛋白表達水平與腎癌患者臨床特點的關系

根據腎癌組織中hMOF蛋白表達水平的綜合免疫組化評分，將患者分為hMOF綜合免疫組化評分≤3分和＞3分2組。比較2組間臨床資料的特點，結果如表1所示：hMOF綜合免疫組化評分≤3分組中平均腫瘤直徑、FuhrmanⅢ級的病例數、≥pT3期的病例數以及腎門淋巴結轉移及遠處臟器轉移的病例數均顯著高于＞3分組，差異有統計學意義（P 值分別為 0.006，0.001，0.039，0.001）。

表1 h M O F蛋白表達水平與腎癌患者臨床特點的關系T a b.1 T h e r e l a t i o n o f h M O F p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l a n d t h e c l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f c c R C C p a t i e n t s C l i n i c a l d a t a h M O F I H C s c o r e s≤3（n=2 6） I H C s c o r e s＞3（n=4 0） P v a l u e M e a n a g e（y e a r） 5 8 6 0 0.7 8 3 M a l e∶f e m a l e 1.4 1.2 0.5 4 5 A v e r a g e d i a m e t e r o f t u m o r（c m） 5.7 3.4 0.0 0 6 F u h r m a nⅢ（%） 6 9.2 1 0.0 0.0 0 1≥p T 3（%） 3 0.7 2 2.5 0.0 3 9 L o c a l l y m p h n o d e o r d i s t a n t m e t a s t a s i s（%） 1 5.4 5.0 0.0 0 1

3 討論

組蛋白乙?；墙M蛋白修飾的重要內容之一，是基因轉錄調控的重要調控機制［3］。MOF又稱MYST1，是組蛋白乙?；易錗YST成員之一，具有組蛋白乙酰化酶活性。MOF最基本的功能是乙?；M蛋白H4第16位賴氨酸，進而產生一系列的生物學作用。研究表明，在人體內，hMOF作用底物不僅僅局限于H4K16［4］。因此，明確hMOF在人體內的功能具有重要意義。目前的研究發現，在前列腺癌及乳腺癌組織中的組蛋白H4呈低乙?；癄顟B［5］，最近Pfister等研究發現：在乳腺癌和成神經管細胞瘤組織中，hMOF在mRNA水平及蛋白表達水平上均較正常組織顯著地降低，并且hMOF的蛋白表達水平與組蛋白H4K16乙?；匠收嚓P，而臨床隨訪中發現，hMOF蛋白表達量與患者術后生存率相關［6］。本研究通過對腎癌組織及正常腎組織的對照研究，明確了腎透明細胞癌組織中hMOF基因在mRNA水平和蛋白質水平均降低，尤其是在FuhrmanⅢ級的癌組織中更為顯著。這說明hMOF缺失將會導致細胞內基因組不穩定，自發的染色體畸變，核形態異常改變，細胞周期功能缺陷等異常［7，8］。通過對腎癌患者臨床數據的整理我們發現，hMOF蛋白表達顯著下降的患者腎癌的惡性程度、疾病的進展程度以及發生遠處轉移的風險均顯著升高。

最近的研究發現：在人體內hMOF作為催化亞基能夠在人體內形成2種乙?；笍秃衔?，這使hMOF在人體內具有更多的乙酰化位點，除了已知的乙酰化位點H4K16以外，hMOF在人體內可能還與H4K5和H4K8的乙?；嘘P［9］。本研究發現，在腎癌組織中隨著hMOF蛋白表達水平的降低，不僅H4K16乙?；斤@著降低，H4K5、H4K8乙?；揭诧@著降低，這3者的乙酰化水平與hMOF蛋白的表達水平呈正相關。因此，我們初步斷定在人體內hMOF蛋白形成的乙?；笍秃衔镒饔玫孜锊粌H僅是 H4K16，還包括H4K5、H4K8，這意味著hMOF基因在人體內具有更復雜的功能，參與到更多的生物學事件中。因此，我們有必要對人體內hMOF酶復合物的構成和功能進行深入研究，闡明hMOF的乙酰基化修飾在人體細胞內的生物學作用。

從腎癌患者的臨床病例特點來看，hMOF蛋白表達顯著下降的患者其Fuhrman分級越高，意味著腎癌的惡性程度越高，生長速度越快，進而腫瘤直徑更大，T分期相對更晚，發生腎門淋巴結轉移、遠處臟器轉移的風險也越高。因此，我們考慮將hMOF蛋白表達水平作為判斷腎癌患者病情嚴重程度的分子標志物，這對于指定患者的治療方案及隨訪方案有積極的意義。

綜上所述，本研究結果顯示：腎透明細胞癌，尤其FuhrmanⅢ級的腎透明細胞癌組織中hMOF基因及蛋白表達水平顯著下降。hMOF的乙?；稽c包括H4K16、H4K5、H4K8，且這3者的乙?；脚chMOF的表達水平呈正比。hMOF蛋白表達水平與腎癌的惡性程度、臨床分期、遠處轉移的風險有關。

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