超聲輻照超聲微泡介導siRNA轉染膀胱癌T24細胞的實驗研究

宋希雙，楊德勇，汪淑晶，車翔宇，王建伯，葉林，王麗娜

（1.大連醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，遼寧 大連 116011；2.大連醫科大學生物化學教研室，遼寧 大連 116011；3.復旦大學附屬腫瘤醫院泌尿外科，上海 200032）

膀胱癌是泌尿系統最為常見的惡性腫瘤，手術治療后腫瘤容易復發。RNA干擾能夠特異性下調膀胱癌細胞內高表達的癌基因，為膀胱癌的基因治療提供有力的手段，具有十分重要的臨床應用價值［1］。然而如何將治療性基因片段在患者體內安全高效、特異的導入腫瘤細胞是亟待解決的問題［2］。病毒載體雖然可以較好的完成這一任務，但其與人基因組整合后出現的致瘤性大大增加了基因治療的危險性，限制了其臨床應用［3］。尋找更加有效的基因轉染方法成為許多基因治療的關鍵。

超聲輻照超聲微泡（microbubble destruction with ultrasound）是一種相對安全、高效的基因轉染方法，超聲波輻照超聲微泡破裂后對細胞產生的空化效應可以使細胞膜的通透性可逆性增加，促進基因向細胞內轉染，具有安全、高效、靶向性強的特點，是一種十分有前途的體內基因轉染方法［4］。在本實驗中，我們使用超聲微泡的方法向T24細胞中轉染熒光標記的siRNA小片段，并通過MTT實驗和流式細胞儀評估其安全性和轉染效率，為尋找安全、特異、高效的體內轉染方法提供體外實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養

人膀胱癌細胞系T24購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。培養于含10%小牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素組成的RPMI 1640培養基中，37℃、5%CO2、、95%濕度的孵箱內。

1.2 主要試劑

FITC標記的陰性對照siRNA由上海吉瑪公司合成。超聲微泡造影劑由重慶醫科大學超聲影像學研究所提供（凍干粉劑型，經第三軍醫大學鈷源輻照中心消毒處理），是內含六氟化碳惰性氣體的脂質類微泡。將約1 g超聲微泡干粉（白色粉末狀）溶解于2 mL PBS中形成白色乳狀溶液，顯微鏡下對微泡進行計數，微泡濃度約為1×107/mL，微泡直徑大小約為2～10 μm。將該溶液置于4℃放置24 h，微泡濃度沒有明顯變化。超聲基因轉染治療儀：UGT 1025型，由重慶醫科大學超聲影像學研究所研制，頻率1 MHz，聲強在 0.4～4 W/cm2范圍內可調。

1.3 細胞轉染

取生長狀態良好的T24細胞在24孔板中培養，細胞長至60%～80%時進行轉染。將超聲微泡造影劑用無菌雙蒸水配制后，記數微泡濃度，按所需終濃度取出所需體積，同樣根據反義寡核苷酸所需終濃度從上述配好的原液中取出所需體積，將2者混合后，輕柔混勻，冰上靜置20 min，即可用于轉染。實驗分為4組：siRNA組（Blank），siRNA+超聲輻照組（U），siRNA+超聲微泡組（MB），siRNA+超聲微泡+超聲輻照組（U+MB）。超聲輻照參數設定在1.2 W，輻照時間30 s。超聲微泡濃度為（1×106/mL），siRNA濃度為30 nmol/L。繼續培養6 h后棄舊培養液同時加入正常培養液，置37℃培養箱中繼續培養48 h后使用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察細胞的轉染效率。

超聲輻照超聲微泡轉染組采用上述參數（1.2 W，輻照30 s），脂質體使用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000，siRNA濃度均為 30 nmol/L，轉染T24細胞48 h后使用流式細胞儀檢測siRNA的轉染效率，使用MTT實驗檢測2種轉染方法對細胞活力的影響。

1.4 MTT實驗檢測細胞活力

設對照組，調零組和處理組，每組設5個復孔。用0.25%的胰酶消化細胞，離心吹打成單細胞懸液，以0.5×104/孔接種于96孔培養板中，每孔200 μL細胞懸液，而調零組只加等量培養液。細胞貼壁正常生長融合度為70%～90%時，對處理組予轉染處理。再將培養板置37℃，5%CO2培養箱中培養48 h后，在每孔加入MTT 20 μL，繼續培養4 h，棄上清液，加入DMSO 200 μL溶解紫色結晶體，適當振搖20 min使其充分溶解，用自動酶標儀測定490 nm波長的吸光度值。

1.5 統計學分析

所有數據均用SPSS 12.0軟件進行統計分析。每一項分析至少有3次結果。數值用±s表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 超聲微泡的穩定性以及超聲輻照破碎微泡的效果

1 MHz，功率為1.2 W的超聲照射微泡10 s，20 s，30 s，40 s，50 s，60 s后，在顯微鏡下對微泡直接進行計數。如圖1所示，在上述超聲參數條件下，當照射時間大于30 s時，超聲微泡可以有效的使微泡發生破裂，與照射前比較照射后微泡濃度降低大于80%。

2.2 超聲輻照超聲微泡可以明顯提高siRNA轉染效率

使用熒光顯微鏡觀察siRNA的轉染效率，使用MTT實驗評估T24細胞的活力。如圖2A所示，與對照組［Blank：（2.12±1.02）%；U：（2.31±3.23）%；MB：（1.89±1.82）%］相比，超聲輻照超聲微泡顯著增加siRNA 的轉染效率［U+MB：（29.57±8.25）%］。MTT實驗結果表明，1.2 W強度超聲輻照超聲微泡30 s對T24細胞活性沒有顯著影響［U+MB：（96.44±8.75）%；Blank：（99.25±10.09）%；U：（98.34±9.11）%；MB：（99.71±9.63）%］（圖 2B）。

2.3 超聲輻照強度和輻照時間對轉染效率和細胞活力的影響

使用熒光顯微鏡觀察不同條件下siRNA轉染T24細胞的效率，并使用MTT實驗檢測不同條件超聲輻照對T24細胞活性的影響。如圖3A所示，在超聲功率1.2 W時，轉染效率隨著輻照時間的增加而增加，但輻照時間超過30 s后轉染效率并沒有明顯增加。T24細胞的在輻照30 s以內沒有明顯變化，但輻照時間超過30 s后細胞活力呈明顯下降趨勢（圖3B）。進而我們選擇超聲輻照30 s，觀察不同超聲功率對siRNA轉染效率的影響。如圖3C所示，隨著超聲功率的增加siRNA轉染效率呈現增加的趨勢，當輻照功率超過1.2 W后siRNA的轉染效率沒有明顯的增加。在超聲輻照強度在1.2 W以內時T24細胞的活力沒有明顯的改變，當輻照強度超過1.2 W時T24細胞的活力呈明顯下降趨勢（圖3D）。

2.4 超聲輻照超聲微泡與脂質體體外轉染siRNA的比較

進一步比較超聲微泡介導的基因轉染與脂質體轉染效率與安全性。如圖4A所示，超聲輻照超聲微泡轉染組的轉染效率［U+MB：（26.86±6.03）%］明顯低于脂質體轉染組［Lipo：（92.34±10.77）%］，2 種方法的轉染效率均顯著高于空白對照。2種轉染方法對細胞活力的影響沒有顯著性差異［U+MB：（90.46±9.04）%；Lipo：（87.66±8.07）%］，（圖 4B）。

3 討論

使用分子生物學的方法對腫瘤進行基因治療很可能成為臨床腫瘤治療的重要手段。安全、高效、特異的將治療性外源基因輸送到腫瘤靶細胞是各種腫瘤基因治療策略成功的關鍵［5］。病毒載體具有較高的體內轉染效率，然而機體對病毒載體潛在的免疫性以及病毒載體整合人基因組后的致畸性和致瘤性等難以克服的障礙限制了其在臨床的應用［6］。陽離子脂質、脂質體、高分子載體材料等非病毒體內轉染方法雖然具有制備簡易，無免疫原性，相對安全等優點，但在體內轉染的效率較低，靶向性差等問題仍有待進一步解決［7］。超聲轉染是一種新型的轉染基因的方法，超聲輻照超聲微泡破裂后產生的機械效應和空化效應能夠可逆性的增加細胞膜通透性，促進外源性基因片段進入到細胞內提高基因的轉染效率［8］。此外，超聲還可以實時監控超聲微泡的分布，選擇性的照射腫瘤部位，提高基因轉染的靶向性。因此，超聲輻照超聲微泡的轉染方法很可能是一種安全、高效、特異的體內基因轉染手段。

超聲微泡主要由外殼和內部包含的氣體兩部分組成，較早使用的超聲微泡內含空氣，目前常規使用的微泡內含惰性氣體。以利聲顯為代表的第一代微泡聲學造影劑，其包裹空氣的殼厚，易破，諧振能力差，而且不夠穩定。以聲諾維為代表的第二代微氣泡造影劑，其內含高密度的惰性氣體六氟化锍，穩定性好。微泡的外殼主要分為3類：白蛋白類，脂質類，和高分子復合物類。相對于白蛋白外殼微泡，脂質類微泡具有更好的穩定性。在本實驗中我們使用的是由重慶醫科大學自制的內含惰性氣體六氟化碳脂質類微泡，具有穩定性好，使用方便等特點。最近出現了高質量的新型聲學造影劑，高安全性、低副作用，微泡大小均勻，直徑小于10 μm并能控制，可自由通過毛細血管，有類似紅細胞的血流動力學特征，穩定性好。然而這些商品化的超聲微泡目前主要用于臨床超聲影響學診斷，用于介導基因轉染還有待于進一步實驗評估。

在本研究中，我們比較了單獨使用超聲照射、單獨使用超聲微泡造影劑以及超聲微泡照射超聲造影劑對siRNA轉染效率的影響。單獨使用超聲照射或單獨使用超聲微泡幾乎沒有任何促進siRNA轉染的效果，說明超聲轉染有賴于超聲照射超聲微泡的緊密結合，然而其具體的促進基因轉染的機制仍然不清楚。較為可靠的機理可能是當超聲照射超聲微泡，微泡發生破裂后產生的機械效應和空化效應可以使細胞膜的通透性短時間內可逆性的增加，因此促進了外源性基因向細胞內的轉移［9］。Taniyama使用電鏡掃描超聲轉染后的細胞形態，證明細胞膜中出現較小的孔狀結構，提示超聲轉染的重要機制之一是增加了細胞膜的通透性。Ran等體外培養大鼠肺動脈血管平滑肌細胞，加入造影劑后用超聲輻照20 s，電鏡觀察證實平滑肌細胞及細胞膜的形態結構可見明顯異常改變，細胞膜表面可見大小不等，數量不一的小孔，呈“彈坑”樣或“火山口”樣，實驗結束后，繼續培養24 h，這些特殊變化消失，證明出現的小孔是可逆的［10］。超聲微泡破裂后對細胞引起的其他生物學效應仍知之甚少，進一步了解探明其發生作用的機制對改善超聲微泡促進基因轉染的效率具有重要意義。

在本實驗中，我們進一步比較了超聲微泡與脂質體基因轉染效率以及對T24細胞活力的影響。超聲微泡介導的基因體外轉染效率仍明顯低于脂質體介導的基因轉染。脂質體目前體是體外基因轉染最為常用的方法，具有轉染效率高、細胞毒性低、使用方便、操作流程成熟等特點［11］。對于多數細胞而言，超聲輻照超聲微泡的體外轉染效率大多不超過40%［12～14］，超聲微泡促進基因轉染作為一種新的轉染手段仍有許多問題需要進一步解決。首先，目前尚沒有專門用于基因轉染的商品化微泡轉染試劑，商品化的微泡造影劑多為臨床超聲影像學診斷使用，而這些試劑用于基因轉染是否需要進一步加工處理，改變、改良某些與基因轉染相關的特性仍未有相關研究。其次超聲微泡促進細胞轉染的轉染過程，具體參數缺乏標準化的流程，目前對于超聲微泡促進基因轉染尚處于研究階段，這種轉染方法還沒有成為基因轉染的常規手段，各種研究所報告的轉染方法以及參數有較大差別，這可能與所使用超聲微泡的特性，轉染細胞的種類，超聲輻照的方法等多種因素有關。然而超聲微泡促進基因轉染已經初步顯示出其良好的臨床應用價值，已有體內實驗證明它是一種有效的體內基因轉染方法，隨著超聲微泡促進基因轉染具體機制研究的不斷深入以及轉染方法的不斷改進，超聲微泡基因轉染技術很可能成為有力的基因轉染方法。

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