HSP70、IL-6和 TNF-α在 CCl4誘導的小鼠急性肝損傷組織中的表達及意義

劉小轉，李三強，任江濤，席守民，徐正順，孫永健

(河南科技大學醫學院，河南 洛陽 471003)

CCl4誘導的肝損傷模型是研究肝損傷的最經典模型，其病理過程中伴隨著肝臟的再生［1］。研究發現，TNF-α、IL-6、熱休克蛋白(HSP70)水平與肝損傷及肝細胞再生密切相關。2010～2011年，我們觀察了CCl4誘導小鼠急性肝損傷過程中HSP70、IL-6和TNF-α的動態變化，探討其在急性肝損傷和肝臟再生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級昆明種雄性小鼠100只，體質量(22±2)g，由河南科技大學實驗動物中心提供。CCl4:分析純，天津凱通化學試劑有限公司;橄欖油(食用油);羊源性TNF-α、IL-6多克隆抗體、HSP70鼠源性單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的兔抗羊、羊抗鼠二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。ALT、AST檢測試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備 取100只小白鼠，按體質量隨機分為觀察組90只和對照組10只。各組均自由飲水，食普通鼠顆粒飼料。觀察組腹腔注射CCl4(濃度 0.1%，溶于食用油中)0.1 ml/10 g 制作急性肝損傷模型，分別在造模后 3、6、12、24、30、36、42、48、54 h頸椎脫臼處死10只小鼠;分別取各組5只(共50只)摘除眼球采血制備血清，另5只取肝臟組織常規固定包埋，制成蠟塊存檔備用。

1.2.2 血清 ALT、AST活性檢測 使用賴氏法檢測，操作嚴格按試劑盒說明書。

1.2.3 肝組織病理組織學觀察 取約5 mm×5 mm×3 mm相同部位的肝組織，10%中性甲醛常規固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。切片厚4 μm，作常規HE染色，光鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.2.4 肝組織 HSP70、IL-6 和 TNF-α 蛋白檢測采用Western blot法。利用考馬斯亮藍G250蛋白定量后，取70 μg蛋白樣品，經 SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉/0.1%Tween20/PBS(PBST)室溫封閉膜30 min，用一抗 HSP70(1∶800)、IL-6(1∶500)和 TNF-α(1∶500)，37℃孵育1 h，PBST洗3次每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶800)或羊抗鼠IgG(1∶800)于37℃孵育1 h，DAB顯色，檢測陽性信號。掃描儀掃描后，用Gel Pro 4.0軟件計算蛋白相對表達值。目的蛋白相對表達值=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量數據以表示，顯著性分析采用ANOVA，數據比較行方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清ALT、AST活性 觀察組與對照組比較，血清ALT、AST呈以下變化趨勢:先逐漸升高，36 h達到高峰，后逐漸減低。詳見圖1。

圖1 觀察組血清ALT、AST變化

2.2 肝臟病理組織學變化 光鏡下觀察HE染色切片，對照組肝細胞形態結構正常，肝細胞索邊界清楚，以中央靜脈為中心呈放射狀分布。觀察組肝細胞不同程度水腫，較廣泛的胞質疏松，脂肪變性;肝血竇擴張充血，結構紊亂，小葉間界限不清，庫普佛細胞增生;可見散在的點狀壞死、片狀壞死及壞死局部炎細胞浸潤。于36 h時病理改變最明顯，后期病理改變有所好轉。

2.3 肝組織 HSP70、IL-6和 TNF-α 蛋白表達 與對照組比較，觀察組肝臟組織HSP70、IL-6和TNF-α蛋白表達明顯呈變化趨勢(P＜0.05):HSP70在3、6、12 h先升高，24 h時降低，30 h至最低點，后再升高。IL-6在3、6、12 h逐漸減低，24 h時升高，30 h至最高點，后又逐漸減低，54 h時仍略高于正常水平;TNF-α先逐漸升高，30 h達到高峰，然后又逐漸降低，但明顯高于對照組。見圖2。

圖2 觀察組肝臟HSP70、IL-6和TNF-α蛋白表達

3 討論

研究發現，TNF-α、IL-6水平與D-氨基半乳糖、乙醇等所致動物實驗性肝損傷以及肝再生密切相關［2，3］。HSP是一類具有維持機體自身穩定功能的應激蛋白，熱與多種刺激均可誘導其表達，特別是HSP70在幾乎所有生物的應激細胞中都經常高度地被誘導。HSP70不僅起到生物應激的保護作用，而且在肝再生過程中也具有重要意義［4］。在本研究中，我們制備了CCl4小鼠急性肝損傷的模型，觀察各模型組小鼠肝臟組織的病理變化，檢測了對照組和觀察組小鼠血清ALT、AST的變化趨勢以及肝組織中HSP70、IL-6和TNF-α的動態表達，從而探討HSP70、IL-6和TNF-α在CCL4誘導小鼠急性肝損傷和肝再生中的作用。肝臟病理組織學結果和各組血清ALT、AST的變化趨勢，進一步證明了CCl4小鼠急性肝損傷的病理過程中伴隨著肝臟的再生過程。

本研究結果顯示，CCl4誘導小鼠急性肝損傷之后肝臟HSP70、IL-6和TNF-α蛋白的表達明顯呈變化趨勢。HSP70在 CCl4處理后3、6、12 h先升高，表明CCl4誘導小鼠急性肝損傷早期，HSP70可能參與了肝組織細胞抗損傷機制的啟動。這可能與HSP70可以提高細胞的應激能力，抵御各種損害因素的影響，維持細胞蛋白自穩，提高細胞對應激原的耐受性，保持細胞內環境的穩定性，參與免疫反應等有關［5］。隨著染毒時間延長，肝臟損傷程度加重，HSP70在CCl4處理后24 h時開始降低，30 h至最低點，這可能與HSP70的合成和功能存在生理老化現象有關系［6］，30 h后，隨著肝損傷的發展，肝臟的再生功能開始啟動，HSP70表達又有逐漸升高的趨勢，說明HSP70可能在肝再生的過程中起一定作用。IL-6在CCl4處理后3、6、12 h表達稍有降低，但變化不明顯，說明在CCl4誘導小鼠急性肝損傷的早期，IL-6的作用并不明顯。在24 h時IL-6的表達開始升高，30 h至最高點，后又逐漸減低;說明在CCl4誘導小鼠急性肝損傷的晚期，肝再生的過程中IL-6具有非常重要的作用。近期有證據表明，IL-6可以不依賴于HGF、TGF、EGF直接促進肝再生，是潛在的肝臟生長影響子，從而調控肝細胞的生長［7］。但是IL-6啟動肝細胞的增殖并不是無限制地進行下去，其本身也存在著負反饋機制［8］，所以，隨著肝再生的完成，又有逐漸減低的趨勢。

TNF-α在CCl4處理后，先逐漸升高，30 h達到高峰，這可能是因為肝臟Kupffer細胞為體內最大的巨噬細胞池，具有產生TNF-α的巨大潛能，是產生TNF-α的主要部位。在肝細胞受損時，對Ca2+的通透性增加，Ca2+內流增加;缺血導致線粒體結構和功能受損，使肝細胞內 ATP的合成減少，Ca2+泵排Ca2+能力和內質網攝Ca2+能力降低，引起細胞內Ca2+超載，Kupffer細胞因Ca2+超載而活化。活化的Kupffer細胞分泌釋放大量TNF-α，TNF-α的高表達可加重肝臟的受損程度［9］，另外，TNF-α可誘導IL-6的合成，TNF-α和IL-6是肝臟再生的早期信號，沒有這些細胞因子，再生過程就不能正常進行。而IL-6反之抑制 TNF-α 的產生［10］，所以，TNF-α 表達在CCl4誘導小鼠急性肝損傷后期又有逐漸降低趨勢，但明顯高于對照組。

綜上所述，在CCl4誘導的急性肝損傷過程中，同時還伴隨著肝臟的修復過程。本研究進一步證實了在肝損傷及再生的過程中HSP70、IL-6和TNF-α均起到了重要作用，為肝臟疾病的預防和治療提供了新的思路。

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