膽管癌組織中Survivin和Caspase-3蛋白表達及與預后的關系

許 鵬，黃 強，劉臣海，謝 放，邵 峰

(安徽醫科大學附屬省立醫院，合肥 230001)

膽管癌是消化系統中預后很差的腫瘤，由于其特殊的解剖部位，早期不易發現，手術根治率低，目前缺乏有效的早期診斷方法。Survivin蛋白為新近發現的凋亡抑制蛋白，與腫瘤的發生、發展有關［1］，參與調控內源性和外源性凋亡路徑［2］;Caspase-3為細胞凋亡通路的關鍵蛋白，Survivin對Caspase-3活性有抑制作用。2005年1月～2007年12月，我們檢測了Survivin蛋白和Caspase-3蛋白在膽管癌和膽管癌癌旁正常膽管組織中的表達情況，探討Survivin和Caspase-3蛋白表達與膽管癌患者的臨床特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 手術切除的膽管癌標本57份(膽管癌組)及癌旁正常膽管組織23份(對照組)，所有患者術前均未做放療、化療等抗腫瘤治療。57例膽管癌患者中男33例，女24例;年齡36～80歲，中位年齡59歲;組織學分型和分化程度依據2000年世界衛生組織(WHO)標準，其中高分化8例，中分化32例，低分化17例;TNM分期按1997年國際抗癌聯盟(UICC)制定的標準，其中Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例，Ⅳ期20例。

1.2 Survivin、Caspase-3 蛋白表達檢測 兔抗人Survivin，Caspase-3多克隆抗體購買于美國Bioworld生物公司;過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素染色試劑盒(SP-9001)購買于北京中杉金橋生物技術有限公司。所有的手術標本均常規經10%甲醛固定、石蠟包埋，連續4 μm切片。組織切片于90℃烤箱中烘烤10 min，二甲苯、梯度乙醇脫蠟;3%過氧化氫5 min以消除內源性過氧化物酶活性;將載玻片浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)中，微波修復抗原10 min;10%正常山羊血清工作液封閉;滴加稀釋的兔抗人 Survivin抗體(稀釋比1∶100)、Caspase-3抗體(稀釋比1∶100)，4℃孵育過夜;滴加生物素化標記山羊抗兔IgG工作液37℃反應1 h;滴加辣根酶標記的鏈霉素卵白素工作液37℃反應1 h;然后DAB顯色4 min，蘇木精復染細胞核、脫水，中性樹脂封片固定，觀察實驗結果。將已知肺癌組織陽性切片結果作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。評分標準:Survivin和 Caspase-3陽性表達主要表現為細胞質或細胞核有棕黃色或棕褐色顆粒沉淀。每張載玻片隨機選用五個光學顯微鏡下(400×)視野，觀察染色強度和陽性細胞百分率，染色強度:無染色為0分，弱染色為1分，中染色為2分，強染色為3分。陽性細胞百分率評分:＜5%為0分;5% ～24%為1分;25% ～49%為2分;50% ～75%為3分;＞75%為4分。每張載玻片由2名高級職稱病理醫師評分，兩項評分的乘積0分為陰性，1～3分為(+)，4～6分為(++)，7～12分為(+++)。其中(+)～(+++)為Survivin和Caspase-3蛋白陽性表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。率的比較采用χ2檢驗;相關性分析運行Spearman相關性檢驗;運用Kaplan-Meier曲線法Long-rank檢驗和建立Cox比例風險模型進行生存分析。所有檢驗均為雙側概率檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin和Caspase-3蛋白表達 膽管癌組與對照組Survivin蛋白表達的陽性率分別為64.9%(37/57)、17.4%(4/23)，Caspase-3 的陽性率分別為 42.1%(24/57)、73.9%(17/23)，P 均 ＜ 0.05。Spearman相關性分析表明，Survivin和Caspase-3蛋白在膽管癌組織中存在負相關(r=－0.415，P=0.001)。

2.2 Survivin、Caspase-3蛋白表達與膽管癌臨床病理參數的關系 見表1。

表1 Survivin、Caspase-3蛋白表達與膽管癌臨床病理參數的關系

2.3 Survivin和Caspase-3蛋白表達與生存期 膽管癌組總體生存時間在3～57個月，中位生存時間26個月。Survivin陽性表達者生存時間明顯短于Survivin陰性表達者 (long Rank=16.535，P=0.000)，Caspase-3陽性表達者生存時間明顯長于Caspase-3 陰性表達者(long Rank=31.629，P=0.000);Cox回歸模型分析表明Survivin表達是膽管癌患者預后的獨立影響因子(HR=5.870，P=0.020)。

3 討論

膽管癌近年來發病率呈上升趨勢，治療效果差，5年生存率為9% ～40%［3］。腫瘤抑制基因的失活或原癌基因的激活是腫瘤發生的重要環節。

Survivin作為凋亡抑制蛋白(IAP)的成員，有報道其參與了腫瘤的發生、發展，與腫瘤血管的生成、凋亡等密切相關［4］，在許多腫瘤均有表達，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等［5］。本研究發現，Survivin蛋白在膽管癌組織中表達率明顯高于癌旁正常組織，與泰興雷等［6］報道一致。Survivin蛋白表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P＜0.05)。表明Survivin表達可促進膽管癌的發生、發展，作為膽管癌惡性程度評價的指標。Survivin蛋白的作用可能通過Casepase家族抑制凋亡［7］;此外還可能通過制細胞色素C的釋放在線粒體水平參與抗凋亡［8］。

在細胞凋亡調控中關鍵家族是Caspase家族，Caspase-3則是Caspase凋亡通路的關鍵蛋白［9］。本研究發現，Caspase-3在膽管癌組織中陽性表達率明顯低于癌旁正常組織;Caspase-3表達與膽管癌患者的分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關，膽管癌分化程度越低、TNM分期級別越高，Caspase-3表達率越低;淋巴結轉移膽管癌患者中，Caspase-3表達較低。即Caspase-3表達缺失可促進膽管癌的惡性轉化。

目前分析Survivn和Caspase-3蛋白表達的關系在許多腫瘤中已有相關的研究，Survivn蛋白對Caspase凋亡通路具有調控抑制作用，黃建民等［10］在喉鱗癌組織發現Survivn和Caspase-3蛋白存在負性相關，在肝癌和胃癌的研究中亦有同樣發現［11，12］;研究表明 Survivn 基因通過對 Caspase-3 的調控影響細胞凋亡［13，14］。本研究發現，膽管癌組37例Survivin蛋白陽性表達中有10例Caspases-3蛋白亦為陽性，Spearman相關性分析表明Survivin和Caspase-3蛋白在膽管組織中存在負性相關，提示Survivn對Caspase-3蛋白的表達存在調控作用。具體的相關可能機制有待于通過分子生物學方法進一步探討。

本研究發現，Survivn陽性表達者總體生存時間明顯短于Survivn陰性表達者;而Caspase-3陽性表達者生存時間明顯長于Caspase-3陰性表達者。證實Survivn過表達和Caspase-3低表達者預后較差。其機制可能為Survivn蛋白對腫瘤血管生長有促進作用，同時通過調控凋亡路徑抑制腫瘤的細胞凋亡。Cox回歸風險比例模型顯示，Survivin蛋白是膽管癌患者預后的獨立危險因子(HR=5.870，P=0.020)。

綜上所述，Survivin蛋白高表達和Caspase-3蛋白低表達對膽管癌的發生、發展可能存在協同作用。

［1］Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.An anti-apoptotic protein hunman surviving is direct inhibitor of caspase-3 and-7［J］.Biochenistry，2001，40(4):1117-1123.

［2］Green DR，Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death［J］.Science，2004，305(5684):626-629.

［3］Zhao P，Lu YL，Zhong M，et al.Inverse correlation of aberrant expression of fragile histidine triad(FHIT)protein with cyclin D1 protein and prognosis in Chinese patients with cholangiocarcinoma［J］.Acta Oncologica，2008，47(8):1557-1563.

［4］Wheatley SP，McNeish IA.Survivin:a protein with dual roles in mitosis and apoptosis［J］.Int Rev Cytol，2005，247:35-88.Review.

［5］Altieri DC.The molecular basis and potential role of survivin in cancer diagnosis and therapy［J］.Trends Mol Med，2001，7(12):542-547.

［6］秦興雷，薛煥洲，王作仁，等.Survivin蛋白在肝外膽管癌組織中的表達及其與預后的關系［J］.中華外科雜志，2009，47(24):1852-1856.

［7］Suzuki A，Hayashida M，Ito T.Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16(INK4a)and Cdk2/cyclinE Complex activation［J］.Oncogene，2000，19(29):3225-3234.

［8］Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates proeaspase 3/p21 comple formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death［J］.Oncogene，2000，19(10):1346-1353.

［9］Riedl SJ，Shi Y.Molecular mechanism of caspase regulation during apoptosis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5(11):897-907.

［10］許亞樺，黃建民.Survivin蛋白與Caspase-3蛋白在喉鱗癌組織中的表達及臨床意義［J］.福建醫藥雜志，2010，32(4):67-68.

［11］馮俊，吳云飛，徐惠綿，等.胃癌組織 Survivin基因上調對Caspase-3表達影響的相關性研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2010，17(14):1083-1085.

［12］王維利，孟剛.Caspase-3與 Survivin在肝細胞肝癌中的表達［J］.安徽醫科大學學報，2006，41(3):278-280.

［13］Karna P，Sharp SM，Yates C，et al.EM011 activates a survivindependent apoptotic program in humannon-small cell lung cancer cells［J］.Molecular Cancer，2009，8(30):93.

［14］Liu J，Enomoto S，Lancto CA，et al.Rutherford.Inhibition of Apoptosis in Cryptosporidium parvum-Infected Intestinal Epithelial Cells Is Dependent on Survivin［J］.Infect Immun，2008，76(8):3784-3792.