原發性肝癌血清蛋白質譜圖人工神經網絡診斷模型研究

胡瓊英，王開正*，譚小林，李小瓊，丁銀環，嚴 莉

(1瀘州醫學院附屬醫院，四川 瀘州 646000;2北京中科亞光生物工程公司)

原發性肝癌(PHC)早期常無癥狀，多數患者發現時已屬中、晚期，喪失了治療的最佳時機，主要原因是目前缺乏特異性高的早期診斷方法［1］。臨床蛋白組學技術—表面增強激光解析電離(SELDI)是隨著蛋白質組學興起的一種新技術，常與時間飛行—質譜(TOF-MS)聯用，可直接對血液、尿液、腦脊液、腹水、細胞裂解液等樣品進行檢測［2］。通過對各種疾病特異性蛋白質動態的分析，繪制出蛋白質指紋譜圖，將該圖譜與正常人或蛋白指紋庫中的譜圖對照比較，可發現和捕獲新的特異性疾病相關蛋白，從而探索疾病早期最微小的指標和征兆［3～6］。2007年11月～2009年11月，我們采用外標法和內標法雙重質量控制措施［7］，采用SELDI-TOF-MS技術篩選出PHC血清差異表達的標志蛋白病建立人工神經網絡診斷模型，旨在探索PHC早期診斷的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 435份血清標本均來源于本院2007年11月～2009年11月住院患者和門診體檢人群，其中男251例，女184例;年齡16～76歲。按照病理診斷和體檢結果分為乙肝組75例、肝硬化組68例、PHC組100例、其他(其他消化系統腫瘤)組91例和健康組101例，按照采集標本的順序將每組分為訓練集和驗證集，乙肝組分別為35、40例，肝硬化組分別為33、35例，PHC組分別為50、50例、其他組分別為41、50例，健康組分別為51、50例。主要試劑與儀器:TFA、SPA、Tris-HCl pH 9.0、PBS Buffer(10×)、HPLC H20、1 M HCl等均購自 Sigma(美國)公司。PBSⅡ/C型蛋白質指紋圖譜儀、金芯片、由美國Ciphergen公司生產。標準雙分子肽內標(相對分子質量分別為2147.7和4263.3)由北京中科亞光生物工程公司生產。

1.2 方法

1.2.1 標本收集及樣品準備 收集合格樣本，按操作流程低溫分離血清，－80℃凍存，待用。取出凍存的血清標本，置于冰上融解后4℃、10000 r/min離心2 min，將分離的血清與10 μl PBS Buffer(10×)和標準分子肽的混合物(1000 μg/ml)按一定比例混合，混勻，按SELDI操作說明上樣，晾干待檢。

1.2.2 重復性試驗 隨機選取1例標本，分為外部組和內部組。外部組完全按照AU芯片的操作過程處理，不添加任何物質;內部組是將人工合成的ACTH和血清以1∶1混合，再按AU芯片的操作過程處理。外部組血清指紋圖譜測定時只需用all in one芯片校準，內部組測定時先用all in one行外部校準，再用已知的ACTH進行相對分子質量和峰強度行內部校準。兩組均于同一天內用飛行質譜儀連續檢測10次(批內)，10 d內分別檢測10次(批間)。分析兩組指紋圖譜相對分子質量和峰強度的變化(變異系數，CV)。

1.2.3 質譜檢測及質譜圖校準 采用 PBSⅡ/C型蛋白質指紋圖譜儀設定優化參數范圍對結合在金芯片表面的血清蛋白質進行檢測;Ciphergen Proteinehip軟件自動采集質譜數據，除噪、平滑處理。儀器采用塞弗吉公司提供的all in one蛋白質標準分子進行外標校正后加入的已知相對分子質量的雙分子內標物進行內標校準。

1.2.4 差異蛋白篩選及統計學分析 Biomarker Wizard 3.1版本軟件分析各組血清差異蛋白質譜峰。對初步篩選的蛋白質峰進行F檢驗，P＜0.05的蛋白質峰差異具有統計學意義，最終篩選出各組具有鑒別價值的蛋白峰。將血清蛋白指紋圖譜中5個差異蛋白峰的高度數據進行統計學分析和評價。

1.2.5 診斷模型建立 采用基于誤差反傳原理的多層前饋(MLP)神經網絡，由輸入層、隱含層和輸出層組成。訓練集7個差異蛋白峰的高度作為輸入層的7個節點，金標準診斷值(原發性肝癌為1，其他為0)作為輸出層的1個節點。訓練時調整隱含層節點數、學習率、動量、訓練次數等參數，直至網絡誤差最小時作為診斷模型并存儲。

1.2.6 模型驗證 將驗證集血清蛋白指紋圖譜中7個差異蛋白峰的高度數據輸入模型進行模擬仿真計算和統計學分析，將所得仿真計算值與臨床診斷進行驗證，根據靈敏度、特異度、準確度和ROC曲線確定診斷閾值。

2 結果

2.1 重復性試驗 結果見表1。3個質譜峰的相對分子質量平均變異系數(CV)批內值為0.065%，批間值為0.08%;3個質譜峰的高度檢測的平均變異系數(CV)批內值為11.08%，批間值為18.32%，說明具有良好的重復性［7］。

表1 SELDI-TOF-MS金芯片檢測血清蛋白質譜指紋圖的重復性

2.2 差異蛋白質峰高度 通過Biomarker Wizard 3.1分析得到75個差異蛋白，其中差別有顯著統計學意義的蛋白質峰15個。找出15個蛋白質峰中高度較高、P值最小、標準差值較小的7個蛋白質峰，蛋白峰 m/z分別是 4207、6604、7734、8106、8545、8599、8894。不同人群差異蛋白峰高度見表2。

表2 各組差異蛋白峰高度統計分析結果比較()

表2 各組差異蛋白峰高度統計分析結果比較()

組別 4207 Da 6604 Da 7734 Da 8106 Da 8545 Da 8599 Da 8894 Da乙肝組 16.95 ±6.94 23.76 ±17.41 36.47 ±15.56 26.32 ±12.98 11.12 ± 7.02 12.98 ±4.86 24.66 ±13.08肝硬化組 6.86 ±2.08 15.89 ±11.99 30.05 ±14.36 26.40 ±15.78 14.20 ± 9.35 15.19 ±8.71 24.02 ±13.77肝癌組 2.75 ±1.57 20.11 ±17.63 28.14 ±18.16 14.52 ± 7.91 15.07 ±10.07 14.89 ±4.83 18.53 ±13.26其他組 9.11 ±4.78 3.72 ± 1.34 45.55 ±15.89 9.24 ± 3.61 7.04 ± 3.59 9.14 ±5.30 13.06 ± 4.38健康組 4.07 ±2.55 27.15 ±18.75 37.30 ±22.44 17.35 ± 6.31 11.04 ± 7.42 12.31 ±7.18 14.12 ± 9.12 F 值 5.15 15.06 6.21 15.37 8.42 5.34 15.20 P值0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 盲法驗證結果 50例PHC患者中(目標輸出值0.3～1之間)有8例判錯，誤認為是其他對照組;而在50例正常對照中(目標輸出值0～0.3)出現9例判錯誤認為原發性肝癌。利用結果數據繪制受試者工作特征曲線(ROC curve)，計算曲線下面積(AUC)為 0.847。

2.4 差異蛋白的初步鑒定 經Swiss-Prot蛋白數據庫檢索，7個差異蛋白質初步溯源情況分別為Peptide YY-like，50S ribosomal protein L30，50S ribosomal protein L35，Neutrophil-activating peptide 2(74)，Acyl carrier protein，30S ribosomal protein S21，UPF0330 protein TK1752。

2.5 診斷性試驗評價指標 該診斷模型檢測原發性肝癌的靈敏度(Sen)為 84%，特異度(Spe)81.25%，陽性預測值(PPV)為 58.33%，陰性預測值(NPV)為94.20%，診斷效率準確度(ACC)為81.90%。

3 討論

PHC具有發現晚、5年生存率低、預后差等特點，其主要原因是目前尚缺乏特異性高、方便易行的早期診斷方法。蛋白芯片聯合質譜技術使得SELDITOF-MS具有高靈敏度和高通量的檢測性能，但是由于受到多種因素和實驗條件的影響，其重現性較差［8］。本研究我們建立了標準分子的二維內標方法，提高了該技術相對分子質量和峰高度檢測的重復性，保證了實驗檢測數據的準確性和可比性。

本研究采用SELDI-TOF-MS技術共篩選出其中7個表達差異最明顯的蛋白質峰，其質荷比(m/z)分別為4207、6604、7734、8106、8545、8599 和8899。7個差異蛋白經 Swiss-Prot蛋白數據庫檢索，可進行初步鑒定，此對差異蛋白的縱向研究有重大意義，可在分子水平上對疾病的發生、發展、轉歸進行解釋。往往一個重要疾病蛋白的發現可成為一種疾病機理研究、早期診斷、早期治療的關鍵，對臨床應用和科學研究都有重要的指導作用。本研究對這7個峰強度分別進行F檢驗，差異有統計學意義。說明其確為五組間有差異的蛋白峰，而不是系統誤差等非分析因素所造成的差異。進一步分析兩兩比較結果，其中原發性肝癌組和其他組相比較的P值均小于0.05，說明原發性肝癌組與各組間差異有統計學意義。采用差異蛋白峰建立原發性肝癌診斷模型，其診斷靈敏度和特異度分別為84.00%和81.25%，相比較于其他實驗室診斷方法而言，其靈敏度和特異度有了較大的提高，且操作方便易行，可能是在分子水平上有效診斷原發性肝癌的新方法。

基于此研究，將對下一步診斷模型的多中心研究和疾病標志物的鑒別研究提供基本的思路。

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