銅綠假單胞菌誘導巨噬細胞凋亡與細胞周期的關系

柴文戍，李 穎

(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001)

銅綠假單胞菌(PA)是種植于支氣管擴張、肺囊性纖維化和慢性阻塞性肺病患者下呼吸道的機會致病菌，可持續刺激宿主免疫反應導致進展性氣道破壞，廣泛存在于土壤、水及各種動物體內，具有多重耐藥的特點［1］，一旦感染，臨床治療十分困難。肺巨噬細胞是肺組織細胞免疫的首道屏障，在肺部特異及非特異免疫系統中起重要作用。國內研究發現，PA 能誘導人類 U937 細胞發生凋亡［2，3］。隨著細胞和分子生物學的發展，人們逐步認識到細胞周期不僅與細胞增殖直接相關，而且與細胞分化和凋亡有關［4］。然而，PA誘導J774細胞凋亡是否與細胞周期有關目前尚不清楚。2009年8月～2010年10月，我們通過流式單染技術檢測細胞凋亡率和細胞周期，探討PA感染宿主的發病機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 PA采用標準菌株ATCC27853，遼寧醫學院第一附屬醫院檢驗中心惠贈，用LB培養基培養。J774巨噬細胞來源于鼠網狀細胞肉瘤，由中國醫學科學院協和醫科大學基礎醫學研究所提供。培養基采用含10%FBS和100 U/ml慶大霉素的高糖型DMEM。Annexin V凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司，其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細菌上清液的制備 在8 ml大豆肉湯培養基中通過振蕩培養法(37℃，8 h)對PA進行增菌，5000 r/min 離心15 min 后，用孔徑0.22 μm 的濾膜過濾，獲得細菌上清液，最后滅火(56℃、1 h)，－20℃儲存備用。

1.2.2 細菌感染細胞 將貼壁的J774細胞常規胰蛋白酶消化傳代，接種于25 cm2的培養瓶中，置37℃、5%CO2培養箱中培養，隔2 d換液1次。生長基本融合的貼壁J774細胞棄培養基，加入2 ml含胎牛血清、不含抗生素的DMEM懸浮細菌液，使J774細胞與PA上清液以15%的濃度混合，37℃水浴中培養3、6、9 h后分別行J774細胞凋亡檢測。同時將實驗分為:①正常對照組(不含PA);②PA感染3 h組;③PA感染6 h組;④PA感染9 h組。

1.2.3 凋亡細胞檢測 ①吉姆薩染色:與PA上清液共培養3、6、9 h后的J774細胞用PBS沖洗2遍，然后用甲醇室溫固定5～7 min，干燥后用吉姆薩染液染色15 min，三蒸水沖洗3遍，空氣中晾干，將蓋玻片用純甘油固定在載玻片上，用普通顯微鏡觀察。②Annexin V/PI單染分析進行細胞凋亡率和細胞周期檢測:取PA上清液作用0、3、6、9 h的細胞上流式細胞儀檢測，按實驗設計處理細胞后，用70%的冷乙醇固定，采用PI一步插入性DNA定量熒光染色法檢測細胞周期和細胞凋亡率。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件，結果以表示，計量資料比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態觀察 吉姆薩染色結果顯示，感染3 h組細胞膜完整但出現發泡現象，感染6 h組出現凋亡細胞的染色質濃縮、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。感染9 h組細胞出現皺縮、變圓，可見凋亡小體。隨著感染細胞時間的延長，各實驗組的凋亡細胞逐漸增多，對照組則不受影響。

2.2 細胞凋亡率和細胞周期檢測結果比較 PA上清液對J774細胞有明顯的抑制生長的作用，流式細胞圖可見典型的亞二倍體凋亡峰，細胞周期分布顯示，9 h內S期細胞隨時間延長而減少，G0/G1期細胞逐漸增多，凋亡率也增加。各實驗組與對照組比較均有統計學差異(P均＜0.01);各實驗組間比較亦有統計學差異(P均＜0.01)。見表1。

3 討論

目前，研究細胞凋亡與細胞周期的關系已成為熱點。本實驗以吉姆薩染色及流式單染技術研究了PA上清液對J774細胞凋亡的誘導作用，發現PA上清液能誘導 J774細胞發生凋亡，與國外研究一致［5］。通過吉姆薩染色觀察細胞形態學改變，感染3 h組細胞膜完整但出現發泡現象，感染6 h組出現凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。感染9 h組細胞出現皺縮、變圓，可見凋亡小體。且隨著J774細胞感染時間延長，凋亡的J774細胞增多。根據流式單染技術證實，S期細胞隨時間延長而減少，G0/G1期細胞漸增多，凋亡率也增加。提示PA以時間依賴方式誘導人J774細胞凋亡，同時說明PA誘導J774細胞凋亡與細胞周期有關。

表1 PA上清液對J774細胞周期分布和凋亡的影響(n=5，%，)

表1 PA上清液對J774細胞周期分布和凋亡的影響(n=5，%，)

注:與0 h比較，*P ＜0.01;與3 h比較，#P ＜0.01;與6 h比較，★P ＜0.01

檢測指標0 h 3 h 6 h 9 h細胞周期G0/G1 57.90 ±1.0062.90 ±0.79* 68.34 ±0.87*# 72.54 ±0.50*#★S 30.82 ±0.6826.49 ±0.63* 20.19 ±0.84*# 11.70 ±0.62*#★G2/M 11.26 ±1.0010.62 ±1.41 11.47 ±0.73 15.76 ±0.27*#★凋亡率 2.78 ±0.3512.44 ±0.56* 30.82 ±0.83*# 41.79 ±1.03*#★

細胞周期是一個動態過程，每個分期互相聯系，不可分割。按DNA合成、分裂過程分為合成前、合成期、合成后期和分裂期，即G0/G1、S、G2和M 期，M期細胞一分為二。影響細胞周期的外界因素如生物、理化因素及缺氧、營養不良等，都可導致細胞周期的各種改變如G1期阻滯、S期蓄積、G2期阻滯和M期延緩等［6］，造成細胞增殖發生障礙。細胞周期的改變既是受損的結果，也是自我保護的表現，周期暫時停止進程，會避免錯誤即受損的DNA復制、分裂，直至缺陷得以糾正，細胞才會順利進入下一時相［7］。較小的DNA損傷引起細胞周期停滯，而較嚴重的DNA損傷使得細胞凋亡。一些關鍵的細胞周期調控蛋白也參與細胞凋亡的調節，提示細胞周期和細胞凋亡存在一個協調的機制。有研究證明，飽和脂肪酸棕櫚酸可促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，且作用呈時間與劑量依賴性。其機制為使細胞周期阻滯于G0/G1期，降低S期細胞比例。提示飽和脂肪酸棕櫚酸抑制細胞的增殖是通過G0/G1期向S期的轉換，阻滯細胞周期進程，影響其復制。

流式細胞儀可通過觀察整個細胞周期DNA含量的變化來分析細胞的凋亡。整個復制周期可以描述為G0/G1、S、G2/M。本研究通過流式單染技術，證明PA上清液能誘導J774細胞凋亡，且與細胞周期有關，具有統計學意義。在細胞調控中，G1～S期調控點是細胞內外信號傳遞、整合匯集到細胞核對細胞增殖進行調控的關鍵點［8］。

綜上所述，PA上清液能誘導J774細胞凋亡，且與細胞周期有關。因此，尋找調節G1～S期調控點的藥物，對臨床抑制PA感染具有良好的前景。

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