尼可地爾超極化停搏對小香豬心肌的保護作用及其對c-Fos蛋白表達的影響

閻興治 ，常忠路，向道康，張文斌，張大國，舒義竹，劉秀倫

(1貴州省人民醫院，貴陽 550002;2山東中醫藥大學第二附屬醫院)

心肌缺血—再灌注損傷是體外循環(CPB)后心肌功能損害形成心臟與其他臟器功能不全或衰竭的主要原因，因此心肌保護仍是一個重要研究課題。尼可地爾是一種硝酸鹽化合物，在體內可激活ATP敏感性鉀(KATP)通道，增加細胞內cGMP生成，提高心肌抗缺氧能力。研究顯示，尼可地爾對離體及體內缺血—再灌注損傷的心肌有明顯的保護作用［1，2］。2009年6～7月，我們觀察了冷血停跳液中加入尼可地爾作為超極化停搏因子對c-Fos蛋白表達的影響，并探討尼可地爾對心肌的保護作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 幼年小香豬12只，雌雄不限，體質量(20.0±5.5)kg(貴陽中醫學院實驗動物中心提供)。德國StocketⅡ型體外循環機，西京-87型鼓泡式氧合器，Adinstruments多導生理記錄儀，Swan-Ganz漂浮導管，尼可地爾(重慶新原興藥業公司，批號:070201)，心肌肌鈣蛋白I(cTnI)試劑盒(大連泛邦生物公司)，c-Fos蛋白試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 隨機將小香豬分為對照組、實驗組各6只。對照組:高鉀去極化含血停搏液［由 St Thomas液(NaCl 110.0 mmol/L，CaCl21.6 mmol/L，MgCl216.0 mmol/L，KCl 16 mmol/L)與血液按1∶2混合］;實驗組:尼可地爾超極化含血停搏液［由尼可地爾 0.2 mmol/L［3］加入 Krebs-Henseleit液中 (NaCl 118.0 mmol/L，KCl 4.74 mmol/L，KH2PO40.93 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，Glucose 1.0 mmol/L)與血液按1∶2混合］，兩種停跳液 pH、PaO2、PaCO2相似。兩組均以首次劑量15 ml/kg灌注，每隔30 min按8 ml/kg追加灌注一次維持心臟停搏狀態。

1.2.2 檢測指標 ①腹腔注射氯胺酮20～30 mg/kg，待意識消失，給予芬太尼 5 μg/kg、哌庫溴銨 4 mg后經口插入氣管導管，接呼吸機行機械通氣，插入肛表監測肛溫，解剖股靜脈置入補液管，生理儀連接四肢監測心臟電—機械活動。胸部正中切口常規建立CPB，慢慢降溫至30℃時阻斷升主動脈，經主動脈根部灌注心臟停搏液，記錄心臟停跳所需時間;每隔30 min重復灌注一次維持心臟停跳狀態，阻斷90 min后開放升主動脈。②實驗中分別于CPB開始后即刻(T1)，阻斷升主動脈后 45、90 min(T2、T3)，開放升主動脈后 45 min、90 min、6 h(T4、T5、T6)抽取靜脈血3 ml，置于干燥試管中，8℃靜置20 min后，3000 r/min離心10 min，留血清置于 －70℃保存。采用ELISA法檢測血清cTnI水平。③開放升主動脈后90 min時取左室心尖部心肌標本0.3 cm ×0.4 cm ×0.3 cm，立即放入 bouin氏液中低溫浸泡、固定24 h后，取出放入75%乙醇溶液浸泡低溫保存。心肌標本經過洗滌、脫水、透明浸蠟包埋后制成石蠟切片，PowervisionTM二步法免疫組化染色測定c-Fos蛋白，以抗體染色后c-Fos蛋白表達的細胞核呈黃褐色為陽性，每張切片隨機選取5個高倍(×200)視野，半定量測定、計算心肌c-Fos蛋白陽性表達率。④每組隨機取3例左室心尖部心肌組織，采用H600型透射電鏡觀察超微結構變化并照片。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件，數據以表示，計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組心肌電—機械活動情況 實驗組致豬心臟停跳所需時間為(57.7 ±7.3)s，對照組為(49.0±6.3)s，兩組比較差異無統計學意義。升主動脈開放心臟復跳后，實驗組有4例出現一過性室顫，對照組僅有1例，兩組一過性室顫發生率比較P＜0.05。其中，實驗組2例自動恢復、2例用電能5 J除顫2次恢復竇性心律，對照組1例自動恢復竇性心律。

2.2 兩組血清cTnI水平比較 見表1。

表1 兩組動物不同時間血清cTnI水平比較 (ng/ml，)

表1 兩組動物不同時間血清cTnI水平比較 (ng/ml，)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n T1 T2 T3 T4 T5 T6實驗組 6 0.063 ±0.008 0.842 ±0.131 1.783 ±0.248＊＊ 2.950 ±0.501＊＊ 2.231 ±0.414*2.093 ±0.254對照組 6 0.064 ±0.011 0.853 ±0.149 2.250 ±0.327 3.433±0.294 2.617 ±0.343 2.280 ±0.318

2.3 兩組c-Fos蛋白陽性表達率比較 兩組缺血—再灌注心肌組織中均有c-Fos蛋白表達，實驗組與c-Fos蛋白陽性表達率為(0.18±0.09)%，對照組為(0.29±0.12)。兩組c-Fos蛋白陽性表達率比較 P ＜0.05。

2.4 兩組電鏡下超微結構比較 實驗組小香豬心肌纖維排列整齊、無斷裂，線粒體基本無腫脹，線粒體嵴相對清晰，無斷裂，糖原顆粒較多;對照組心肌纖維疏松，排列紊亂，部分斷裂、溶解，線粒體腫脹，部分線粒體空泡樣變，線粒體嵴紊亂、模糊不清并有斷裂，糖原含量少。

3 討論

通過升高心肌細胞外K+濃度誘導心臟去極化停搏是一種應用廣泛的心臟停搏技術，但是去極化停搏后伴隨Na+、Ca2+超載引起的離子平衡紊亂，將不可避免地導致心肌損傷。因此，有學者提出了維持心肌細胞膜電位(Em)在超極化狀態，即低于靜息Em的心臟超極化停搏［4］。KATP通道開放劑的心臟停搏機制通常認為是由于細胞膜對K+相對電導遠遠強于對Na+相對電導，因此心肌細胞靜息Em(－80 mV)接近于K+平衡電位(－94 mV)。KATP通道開放劑誘導KATP通道激活，將增加細胞膜對離子的電導差異，導致Em向K+平衡電位移動(較先前的Em超極化)。如果Em保持低于－65 mV的狀態，那么觸發動作電位的電壓依賴性快Na+通道將不能被激活，心臟即停搏于舒張期［5］。其理論上的優點為:①在超極化停搏狀態下，心肌細胞質膜中的離子通道或泵極少被激活，可減少心肌高能磷酸鹽的消耗;②心肌細胞靜息 Em處于超極化狀態，Na+、Ca2+通道關閉，減少缺血心肌細胞Na+、Ca2+超載，進而減輕心肌缺血—再灌注損傷。

尼可地爾可通過激活KATP通道并使之開放誘導心臟超極化停搏，主要是通過加快動作電位第3期K+外流而縮短單相動作電位時間，造成Na+、Ca2+內流減少，從而減少Ca2+釋放和心肌的收縮活動，降低ATP的消耗，從而減輕細胞的缺血性壞死［6］。本實驗結果顯示，尼可地爾有良好的心肌保護作用，但其致心律失常作用明顯。這可能與尼可地爾引起的心肌細胞KATP通道的普遍開放，使膜電位下降有關，其一方面抑制了鈣超載和基質腫脹，減輕了心肌損害;而另一方面則縮短了動作電位時程和有效不應期，使折返易于誘發和維持，加重了心律失常的發生危險。因此，我們認為KATP通道開放劑的價值評估還需進一步全面、系統的研究。

cTnI是一種心肌收縮調節蛋白，心肌細胞受損時開始釋放入血，是心肌損傷的特異性指標。本實驗結果顯示，實驗組血清cTnI釋放量明顯低于對照組，說明KATP通道開放劑尼可地爾超極化停搏可以更好地維持心肌細胞正常結構，減輕心肌細胞缺血—再灌注損傷。從形態學上觀察，其超微結構損傷較對照組明顯減輕。

c-Fos蛋白是一種可以誘導細胞凋亡的即刻早期基因c-Fos的蛋白產物，是心血管系統應激反應基因和蛋白，細胞內鈣超載和氧化應激可以引起c-Fos過度表達［7］。Nelson 等［8］在對心肌缺血—再灌注損傷的研究中發現，即刻早期基因c-Fos和c-Jun、TIS7/PC4均表達增高，這些基因的表達既參與CPB介導炎癥反應相關基因的激活，又參與損傷后的心肌和血管重構。本實驗結果顯示，c-Fos蛋白表達實驗組明顯低于對照組，表明超極化停搏有良好的心肌保護作用，其機制可能為尼可地爾超極化停搏抑制細胞內鈣超載、減輕線粒體基質腫脹進而抑制c-Fos蛋白表達有關。

［1］鹿欣，劉立群，陳維寧，等.尼可地爾后處理聯合預處理對離體心肌缺血/再灌注的作用研究［J］.中華臨床醫師雜志，2007，1(6):28-33.

［2］Steensrud T，akobsen Q，Ytrehus K，et al.Contractile recovery of heart muscle after hypothermic hypoxia is improved by nicorandil via mitochondrial KATPchannels［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2006，30(2):256-262.

［3］Steensrud T，Muller S，Endresen PC，et al.Clinical testing of nicorandil supplemented normokalemic cardioplegic solution［J］.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2006，5(5):521-525.

［4］Yu T，Yu Z，Liu X，et al.Myocardial protection with pinacidil induced hyperpolarized arrest during cardiopulmonary bypass［J］.Chin Med J(Engl)，2001，114(2):1245-1248.

［5］Hoenicke EM，Sun X，Strange RG Jr，et al.Donor heart preservation with a novel hyperpolarizing solution:superior protection compared with University of Wisconsin solution［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2000，120(4):746-754.

［6］Fukuda H，Luo CS，Gu X，et al.The effect of KATP channel activation on myocardial cationic and energetic status during ischemia and reperfusion:role in cardioprotection［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33(3):545-560.

［7］Maulik N，Sasaki H，Addya S，et al.Regulation of cardiomyocyte apoptosis by redox-sensitive transcription factors［J］.FEBS Lett，2000，485(1):7-12.

［8］Nelson DP，Wechsler SB，Miura T，et al.Myocardial immediate early gene activation after cardiopulmonary bypass with cardiac ischemia-reperfusion［J］.Ann Thorac Surg，2002，73(1):156-162.