藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌A549細胞凋亡的誘導作用

孫雪飛，裴艷濤，尹秋偉，楊國濤，吳銘生

(山東大學齊魯醫院，濟南 250012)

藤梨根為軟棗獼猴桃的根，味甘、咸寒、微澀，具有清熱解毒、消腫疥、祛風濕的功效。既往常用于抗腫瘤治療，尤其對消化道腫瘤療效較佳。我們以往的研究發現，藤梨根乙酸乙酯提取物對體外培養的肺癌細胞有較好的抑制作用［1］。2009年10月～2010年5月，我們以此為基礎，觀察了藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌A549細胞凋亡的誘導作用，并對其作用機制進行了探討?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細胞系由山東省醫學科學院基礎所惠贈。TUNEL試劑盒、SP免疫組化染色試劑盒、鼠抗人Survivin單克隆抗體均購自北京中山生物技術有限公司;RPMI 1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司;溴化乙錠(BE)、胰蛋白酶為美國Sigma公司產品;捷達801系列形態學分析系統為江蘇捷達科技發展有限公司產品;RNA提取液(TRIzol)購自Life Technologies公司;RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司;BioPhotometer型微量核酸定量儀為Eppendorf公司產品;MJ-PTC200 PCR儀為MJ research公司產品。藤梨根乙酸乙酯提取物自行制備。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 肺癌A549細胞培養在含10%小牛血清，青霉素及鏈霉素各100 U/ml的RPMI 1640培養液中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代。以二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑，將藤梨根乙酸乙酯提取物濃度在臨用前用RPMI 1640培養液分別配制為40、80、160 μg/ml，并以其濃度分組，為實驗組;同時設對照組(0.04%DMSO+細胞)。取對數生長期的肺癌A549細胞用于實驗。

1.2.2 肺癌A549細胞DNA裂解片斷的檢測 取肺癌A549細胞，調整細胞密度為5.0×105個/ml，接種于含RPMI 1640培養液的25 ml培養瓶中，每瓶3 ml。培養24 h后更換培養液，實驗組分別加入40、80、160 μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物，并設對照組(0.04%DMSO+細胞)，CO2孵箱內培養48、72 h后，分別收集1×106個細胞，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA梯狀條帶。

1.2.3 藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌A549細胞凋亡率的影響 將經多聚賴氨酸處理的小載玻片預先置于12孔細胞培養板中，取肺癌A549細胞，調整細胞密度為1.0×105個/ml，接種細胞于培養板。待細胞貼壁生長良好時，棄原培養液，分別加入新配制的40、80、160 μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物 3 ml，每個濃度設3個復孔，并設對照孔(0.04%DMSO+細胞)。置于培養箱分別中培養24、48、72 h，棄去孔內培養液，取出載玻片上，晾干，4%多聚甲醛固定15 min(4℃)。采用TUNEL檢測用藥后肺癌A549細胞凋亡率的變化。

1.2.4 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549細胞Survivin蛋白表達 將經多聚賴氨酸處理的小載玻片預先置于12孔細胞培養板中，取肺癌A549細胞，調整細胞密度為1.0×105個/ml，接種細胞于培養板。待細胞貼壁生長良好時，棄原培養液，加入40、80、160 μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物 3 ml，并設對照孔(0.04%DMSO+細胞)，每組設3個復孔。置于培養箱分別培養24、48、72 h，棄去孔內培養液，取出載玻片上，晾干，4%多聚甲醛固定15 min(4℃)。采用免疫組化SP法檢測藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549細胞Survivin蛋白表達。組織抗原修復采用微波抗原修復法;Survivin蛋白單抗工作濃度均為1∶100。采用已知陽性對照片作陽性對照;以PBS代替一抗作陰性對照。Survivin蛋白陽性染色反應為胞質內見黃色或棕黃色顆粒。將其置于Olympus顯微鏡下400倍高倍視野下觀察，對所測部位進行準確定位后，由攝像系統提取數值化細胞圖像輸入捷達801系列形態學分析系統，選取4個視野進行陽性率測定。

1.2.5 藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549細胞Survivin mRNA的表達 取肺癌A549細胞，調整細胞密度為1.0×106個/ml，接種于24孔培養板中，每孔1 ml，培養24 h待細胞貼壁生長良好時，棄原培養液，加入40、80、160 μg/ml的藤梨根乙酸乙酯提取物，并設對照孔(0.04%DMSO+細胞)，每組設3個復孔。37℃、5%CO2飽和濕度下分別培養24、48、72 h，收集細胞總數約為1×106個。采用RT-PCR法對藤梨根乙酸乙酯提取物作用后肺癌A549細胞Survivin mRNA表達進行半定量分析。設β-actin為內參照，Survivin上游引物序列為 5'-CAAAGAAAGTCCGCTGTGCC-3';下游引物序列為5'-TCCCTCACCCTGCTAAGTCC-3';擴增片斷為大小326 bp。β-actin上游引物序列為5'-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3';下游引物序列為5'-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3';擴增產物大小為224 bp。上述引物序列均由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件，結果以表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后DNA裂解片斷比較 對照組細胞DNA凝膠電泳未見明顯的DNA梯狀條帶圖譜。用藥48、72 h后3種濃度藤梨根乙酸乙酯提取物作用后的細胞DNA凝膠電泳均出現凋亡細胞所特有的DNA梯狀條帶圖譜，即180～200 bp及其整數倍數的DNA片段成梯狀排列。

2.2 不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物作用不同時間對肺癌A549細胞調亡率、Survivin蛋白表達及Survivin mRNA表達的影響 見表1。

表1 不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物作用不同時間對肺癌A549細胞調亡率、Survivin蛋白及mRNA表達的影響()

表1 不同濃度藤梨根乙酸乙酯提取物作用不同時間對肺癌A549細胞調亡率、Survivin蛋白及mRNA表達的影響()

注:與對照組比較，*P＜0.01;實驗組中各濃度比較無統計學意義，但存在量效—時效梯度

組別 n 凋亡率(%)24 h 48 h 72 h Survivin蛋白表達(%)24 h 48 h 72 h Survivin mRNA 的表達24 h 48 h 72 h對照組 3 2.06 ±0.45 2.53 ±0.67 2.83 ±0.64 35.82 ±1.9635.88 ±2.3735.52 ±3.04 0.716 ±0.069 0.785 ±0.057 0.790 ±0.042實驗組40 μg/ml 3 9.45 ±1.87*14.23 ±3.33*29.55 ±4.42* 29.73 ±2.6122.57 ±2.80*16.46 ±3.91* 0.635 ±0.028*0.541 ±0.097*0.436 ±0.096*80 μg/ml 3 13.74 ±2.34*32.43 ±4.59*44.29 ±3.83* 24.15 ±3.16*19.32 ±3.46*10.36 ±2.54* 0.524 ±0.068*0.466 ±0.087*0.352 ±0.084*160 μg/ml 3 24.38 ±3.61*40.71 ±4.08*53.46 ±4.64* 17.32 ±2.46*12.35 ±2.13*6.56 ±2.04* 0.443 ±0.102*0.364 ±0.080*0.282 ±0.071*

3 討論

用藤梨根組方治療腫瘤在我國由來已久，浙江溫州地區民間就流傳用壁虎(米炒焦研粉)、藤梨根煮紅棗治療胃癌、肺癌，效果較好。近年研究表明，藤梨根復方制劑在體內外均有抑制腫瘤轉移［2］、逆轉多藥耐藥［3］、對化放療減毒增效［4，5］的作用。但上述研究是采用藤梨根復方制劑進行，關于藤梨根單體及其有效成分抗腫瘤研究少見報道。我們既往研究結果顯示，藤梨根乙酸乙酯提取物在體外可以誘導肺癌細胞凋亡，但其作用機制尚不明確［1］。本研究采用DNA瓊脂糖凝膠電泳及TUNEL技術，再次證實藤梨根乙酸乙酯提取物在體外可以明顯促進肺癌A549細胞凋亡，并存在時相性和劑量依賴性。由于細胞凋亡時DNA斷裂早于形態學改變及DNA含量減少，因此TUNEL技術可以早期檢出未發生形態改變的細胞凋亡，所以本次實驗中所得肺癌細胞凋亡率略高于前次流式細胞儀凋亡檢查結果［1］，證實誘導肺癌細胞凋亡是藤梨根乙酸乙酯提取物抗肺癌作用的重要機制。

細胞凋亡是受多種基因精細調控的，并通過凋亡相關的信號傳導系統介導來實現，因此在接受死亡信號后細胞是否發生凋亡，與凋亡相關基因表達密切關系。除Bcl-2家族外，Survivin作為凋亡抑制因子家族的新成員在細胞凋亡調控中也發揮重要作用。Survivin是迄今為止發現的最強凋亡抑制因子，其高表達能抑制多種因素如p53、Caspases等誘導的細胞凋亡。Survivin可直接作用于Caspase，主要與Caspase-3和Caspase-7結合，阻斷細胞凋亡過程［6］。還通過與紡錘體纖維的結合，間接抑制Caspase對紡錘體的水解作用，有利于保護有絲分裂細胞器的完整性，抑制細胞凋亡［7］。此外，Survivin還可通過與細胞周期調控因子cdk4結合，形成Survivin-cdk4復合體，使p21從cdk4的復合體中釋放出來，p21進一步與線粒體Caspase-3結合，抑制其活性，從而抑制 Fas介導的細胞凋亡［8，9］。最近研究發現，熱休克蛋白Hsp90可以和Survivin結合，從而提高腫瘤細胞抗凋亡的閾值，促進腫瘤細胞增殖［10］。

本研究采用免疫組織化學和RT-PCR法觀察藤梨根乙酸乙酯提取物對肺癌細胞Survivin基因表達的影響，并對其進行半定量分析，從蛋白和基因水平對其作用機制進行闡述。結果顯示，對照組A549細胞Survivin蛋白及mRNA表達水平較高，而經過藤梨根乙酸乙酯提取物處理后A549細胞Survivin蛋白及mRNA表達水平均有下降，并且隨著作用時間延長，藤梨根乙酸乙酯提取物濃度加大，藤梨根乙酸乙酯提取物對他們表達的抑制作用逐漸增強，存在量效和時效關系。表明藤梨根乙酸乙酯提取物可以在基因和蛋白水平下調Survivin基因的表達，來誘導A549細胞凋亡，而對凋亡相關基因表達的調控可能是藤梨根乙酸乙酯提取物誘導肺癌細胞凋亡的分子機制之一。本研究在深層次上認識藤梨根的藥理作用機制，為更有效地將藤梨根提取物用于臨床治療肺癌提供了實驗和理論依據。

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