非重型再生障礙性貧血患者血清對(duì)32D細(xì)胞凋亡及Stat3蛋白磷酸化的影響

林贈(zèng)華，劉 紅，姜?jiǎng)偃A，陸 偉，宋國(guó)齊，李俊宏

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001)

我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，再生障礙性貧血(AA)患者血清中存在造血抑制物，其主要成分為干擾素-γ(IFN-γ)，可能通過(guò)影響JAK-STAT途徑促進(jìn)CD3+4細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致AA的發(fā)?。?］，并且發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Stat3)的磷酸化水平增高可能與重型再生障礙性貧血(SAA)患者造血干祖細(xì)胞過(guò)度凋亡有關(guān)［2］，但Stat3的磷酸化是否參與非重型再生障礙性貧血(NSAA)患者的造血功能衰竭尚不清楚。2009～2010年，我們通過(guò)觀察NSAA患者血清孵育32D細(xì)胞過(guò)程中Stat3分子的磷酸化水平和細(xì)胞凋亡的變化，旨在探討Stat3磷酸化在NSAA患者造血細(xì)胞過(guò)度凋亡中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院初治的、未行NSAA治療(包括輸血)的原發(fā)獲得性NSAA患者12例，均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，男7例、女5例，年齡29～55歲。同期選擇我院健康體檢者12例作對(duì)照者，男7例、女5例，年齡28～57歲。兩組患者性別、年齡具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取NSAA患者及正常對(duì)照者外周靜脈血5 ml，分離血清，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，－20℃保存，用于培養(yǎng)32D細(xì)胞(由美國(guó)俄亥俄州Toledo大學(xué)惠贈(zèng));WEHI-3B細(xì)胞(由美國(guó)俄亥俄州Toledo大學(xué)惠贈(zèng))用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，首次傳代時(shí)棄掉培養(yǎng)液上清，第二次傳代后培養(yǎng)5 d，1000 r/min離心5 min，收集所有上清(含32D細(xì)胞生長(zhǎng)所需的IL-3)，經(jīng)過(guò)濾后凍存;在RPMI 1640培養(yǎng)液中加入10%的IL-3和10%的對(duì)照組或NSAA組血清培養(yǎng)32D細(xì)胞，按所加血清不同分為對(duì)照組和NSAA組，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 磷酸化Stat3蛋白(p-Stat3)和Stat3蛋白表達(dá)檢測(cè) 分別于血清孵育0、12、24、36、48 h后收集32D細(xì)胞懸液(均再饑餓4 h)，加入裂解液，4℃裂解30 min，13000 r/min、4 ℃ 離心 15 min，吸取上清，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，取30 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，全濕法轉(zhuǎn)膜，4℃封閉10 h，加入1∶250 p-Stat3一抗，4℃孵育10 h，TBS-T液洗膜后加入1∶1000二抗，4℃孵育2 h，洗膜后加入發(fā)光液進(jìn)行顯影、定影。檢測(cè)Stat3蛋白表達(dá)時(shí)一抗稀釋倍數(shù)為1∶500，余條件同上。膠片掃描后分析Stat3和p-Stat3的表達(dá)量，Stat3磷酸化水平以p-Stat3/Stat3比值表示，選擇Stat3磷酸化水平差異最大的時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡率檢測(cè)血清孵育24 h后收集細(xì)胞懸液，計(jì)算每毫升中的細(xì)胞總數(shù)，用錐蟲(chóng)藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活率。另外收集2.5×105個(gè)細(xì)胞，備份作為陰性對(duì)照;按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟加入5 μl Annexin-V/FITC溶液和10 μl PI溶液(陰性對(duì)照管不加);避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞早期凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者Stat3磷酸化水平比較 見(jiàn)表1。

2.2 兩組患者細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活率比較 孵育24 h后，NSAA組細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活率分別為(118.6 ±4.7) ×104/ml、(92.9 ±2.0)%，而對(duì)照組分別為(135.8 ±5.8) ×104/ml、(96.2 ±1.1)%，兩組間細(xì)胞計(jì)數(shù)比較P＜0.05，而細(xì)胞存活率比較P＞0.05。

表1 各時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞內(nèi)Stat3蛋白磷酸化水平()

表1 各時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞內(nèi)Stat3蛋白磷酸化水平()

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

對(duì)照組 12 0.39 ±0.03 0.76 ±0.05 0.78 ±0.04 0.90 ±0.06 0.88 ±0.02 NSAA 組 12 0.39 ±0.03 0.89 ±0.04 0.95 ±0.03*0.93 ±0.03 0.91 ±0.04

2.3 兩組患者細(xì)胞凋亡率比較 孵育24 h后，NSAA組細(xì)胞凋亡率為(4.05±0.35)%，對(duì)照組為(2.20±0.31)%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

通過(guò)對(duì)AA患者骨髓中的造血干細(xì)胞過(guò)度凋亡現(xiàn)象的研究有助于揭示AA造血功能衰竭的機(jī)制，但AA患者骨髓中造血細(xì)胞極少，常難以取得足夠供研究的細(xì)胞，這嚴(yán)重限制了對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究。本研究以32D細(xì)胞——一種正常小鼠骨髓多能干細(xì)胞靶細(xì)胞，分別給予NSAA患者及正常人的血清加以孵育，結(jié)果表明NSAA組的細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少而細(xì)胞凋亡率卻明顯增高，證實(shí)NSAA患者的血清中存在造血抑制物，但與SAA患者的血清相比對(duì)32D細(xì)胞促凋亡作用相對(duì)較弱［2］，提示AA患者的血清中造血負(fù)性調(diào)控因子的活性強(qiáng)度或濃度可能與AA的分型有關(guān)。

以往研究發(fā)現(xiàn)，不同類(lèi)型AA患者體內(nèi)的淋巴細(xì)胞水平、T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平等均不同［3］。而我們也曾發(fā)現(xiàn)，SAA患者血清誘導(dǎo)32D細(xì)胞凋亡過(guò)程中磷酸化蛋白激酶B蛋白的表達(dá)顯著低于NSAA組，而磷酸化蛋白激酶C表達(dá)水平則相反［4］，提示SAA和NSAA的發(fā)病機(jī)制可能有所差別。本研究結(jié)果顯示，NSAA組細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示NSAA患者血清主要通過(guò)增加細(xì)胞凋亡率來(lái)影響32D細(xì)胞的增殖，而SAA患者血清對(duì)32D細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用主要通過(guò)增加細(xì)胞凋亡率來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，NSAA組血清誘導(dǎo)32D細(xì)胞內(nèi)Stat3蛋白磷酸化水平的能力低于既往研究中SAA組的血清［2］，進(jìn)一步提示二者抑制32D細(xì)胞增殖的作用機(jī)制不盡相同。

造血調(diào)控因子能控制骨髓造血細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程，雖然AA患者骨髓和外周血中造血正向調(diào)控的細(xì)胞因子濃度甚至高于正常人，但造血細(xì)胞卻出現(xiàn)過(guò)度凋亡的現(xiàn)象，這說(shuō)明了AA患者血清中的 IFN-γ、TNF-α、IL-2等造血負(fù)性調(diào)控因子的作用超過(guò)造血正向調(diào)控的細(xì)胞因子的作用。作為一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，IFN-γ在動(dòng)物及人體內(nèi)均可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致全血細(xì)胞減少［5］，我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，并證實(shí)其也在AA患者骨髓造血細(xì)胞過(guò)度凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵作用［1，2，4］。

IFN-γ可通過(guò)JAK-STAT途徑促進(jìn)Stat3的活化來(lái)調(diào)節(jié)造血干祖細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育等過(guò)程［6］，而活化后的Stat3主要為p-Stat3，可將細(xì)胞因子等的刺激傳遞到細(xì)胞核，啟動(dòng)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄［7］，研究表明JAK-STAT通路的持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，故STAT3曾被定義為癌基因［8］。

目前實(shí)驗(yàn)研究表明，Stat3在某些情況下也可也發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用。p-Stat3進(jìn)入細(xì)胞核后可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)磷酸化的絲/蘇氨酸蛋白激酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的表達(dá)、上調(diào)X連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1、Noxa和整合素的表達(dá)等來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［9］;此外，在多種細(xì)胞中 IFN-γ還通過(guò)促進(jìn) p-Stat3的形成來(lái)誘導(dǎo)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的合成，而iNOS是體內(nèi)一氧化氮生成的主要限速因素，會(huì)通過(guò)一氧化氮的過(guò)量產(chǎn)生和釋放來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加［9，10］;Yang 等［11］研究也表明，IFN-γ 可通過(guò)活化Stat3使血管平滑肌細(xì)胞對(duì)通過(guò)死亡受體和線粒體途徑激發(fā)的凋亡更加敏感，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。上述研究結(jié)果均提示IFN-γ可通過(guò)活化Stat3來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而本研究結(jié)果則顯示NSAA患者的血清在體外作用12、24、36、48 h均可提高 Stat3蛋白的磷酸化水平，且與對(duì)照組相比，血清作用24 h時(shí)兩組之間差異最大，同時(shí)伴有32D細(xì)胞凋亡率的顯著增加，提示 Stat3蛋白的磷酸化增多可能參與NSAA患者血清誘導(dǎo)32D細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。

AA患者血清中的造血負(fù)調(diào)控因子除了IFN-γ外，尚有TNF-α、IL-2等，二者也可以通過(guò)JAK-STAT途徑激活Stat3使p-Stat3增多。因此，不能排除NSAA患者血清中其他造血負(fù)性調(diào)控因子對(duì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)Stat3磷酸化的作用。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，早幼粒細(xì)胞白血病蛋白、半胱氨酸蛋白酶8、磷酸化蛋白激酶B等均參與介導(dǎo)SAA患者血清誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程［3，12］，這說(shuō)明參與 AA 患者血清誘導(dǎo)32D細(xì)胞過(guò)度凋亡的細(xì)胞因子與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路可能較多。由于細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡信號(hào)的通路復(fù)雜，Stat3分子磷酸化很可能僅僅是NSAA患者血清中IFN-γ等造血負(fù)調(diào)控因子增多引起的一種現(xiàn)象，可能與其誘導(dǎo)32D細(xì)胞過(guò)度凋亡無(wú)關(guān)，故Stat3分子磷酸化是否與NSAA患者血清促進(jìn)32D細(xì)胞凋亡有關(guān)需要得到更多實(shí)驗(yàn)研究的證實(shí)。

［1］童來(lái)根，劉紅，林贈(zèng)華，等.IFN-γ對(duì)Akt基因激活的鼠32D細(xì)胞的影響及作用機(jī)制的探討［J］.中華血液學(xué)雜志，2010，31(12):825-828.

［2］林贈(zèng)華，劉紅，李俊宏，等.重型再生障礙性貧血患者血清對(duì)小鼠造血干/祖細(xì)胞株32D細(xì)胞凋亡和STAT3、STAT5分子表達(dá)的影響［J］.中華血液學(xué)雜志，2009，30(11):767-769.

［3］上海市中美聯(lián)合白血病協(xié)作組.上海地區(qū)成人獲得性再生障礙性貧血患者診斷和治療現(xiàn)狀—附142例分析［J］.中華血液學(xué)雜志，2010，31(4):275-278.

［4］楊小飛，劉紅，錢(qián)軍，等.再生障礙性貧血患者血清對(duì)小鼠髓系前體細(xì)胞凋亡及蛋白激酶B表達(dá)的影響［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(11):4-6.

［5］Welsh JP，Rutherford TR，F(xiàn)lynn J，et al.In vitro effects of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha onbone marrow progenitor cells from aplastic anemia patients and normal donors［J］.Hematol J，2004，5(1):39-46.

［6］Hankey PA.Regulation of hematopoietic cell development and function by Stat3［J］.Front Biosci，2009，14:5273-5290.

［7］Snyder M，Huang XY，Zhang JJ.Stat3 directly controls the expression of Tbx5，Nkx2.5，and GATA4 and is essential for cardiomyocyte differentiation of P19CL6 cells［J］.J Biol Chem，2010，285(31):23639-23646.

［8］Johnston PA，Grandis JR.STAT3 signaling:anticancer strategies and challenges［J］.Mol Interv，2011，11(1):18-26.

［9］Bai YL，Ahmad U，Wang Y，et al.Interferon-γ induces X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor-1 and noxa expression and potentiates human vascular smooth muscle cell apoptosis by STAT3 activation［J］.J Biol Chem，2008，283(11):6832-6842.

［10］Zaragozá R，Bosch A，García C，et al.Nitric oxide triggers mammary gland involution after weaning:remodelling is delayed but not impaired in mice lacking inducible nitric oxide synthase［J］.Biochem J，2010，428(3):451-462.

［11］Yang L，Dybedal I，Bryder D，et al.IFN-gamma negatively modulates self-renewal of repopulating human hemopoietic stem cells［J］.J Immunol，2005，174(2):752-757.

［12］劉紅，陸德炎，楊錦媛，等.重型再生障礙性貧血患者血清誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及PML蛋白表達(dá)［J］.中華血液學(xué)雜志，2003，24(11):596-597.