LOX-1在糖尿病大鼠大血管病變中的表達及普羅布考的干預作用

楊小清，鄭少雄

(天津醫科大學第二醫院，天津 300211)

凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)主要在血管內皮表面表達，動脈粥樣硬化病變血管LOX-1的表達明顯增強，氧化應激是血管內皮LOX-1表達的重要原因。普羅布考具有較強的抗氧化作用，從而具有抗動脈粥樣硬化的作用。2006年1月～2007年12月，我們對普羅布考對2型糖尿病大鼠大血管病變處LOX-1表達的影響及其作用機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型的制備 健康雄性SD大鼠50只，體質量約220 g，購于北京大學醫學部試驗動物中心，隨機分為A、B、C和D四組。A組為正常對照組(10只)，給予普通飲食;B、C和D組為高糖高脂飼養組，8周后給予小劑量STZ造糖尿病模型。其中B組(13只)在高糖高脂飲食起始的同時給予普羅布考干預;C組(13只)在高糖高脂飲食8周并行小劑量STZ造模后給予普羅布考干預8周;D組(14只)在造模前后均給予高糖高脂飲食，不給普羅布考干預?？崭寡菧y定結果＞16.7 mmol/L為2型糖尿病造模成功。

1.2 原位活性氧(ROS)水平及LOX-1mRNA、蛋白水平的檢測 造模后8周所有動物稱量，取血測定血糖、血脂，并處死動物，取主動脈弓處血管進行鏡下觀察及ROS、LOX-1測定。ROS 測定采用免疫熒光法。LOX-1 mRNA行RT-PCR半定量測定，采用VDS450型凝膠影像分析系統采集圖像并行LOX-1/β-actin比值的半定量分析。LOX-1蛋白含量測定用Lowry法(試劑盒購自美國Santa Cruz公司)，對LOX-1和內參β-actin特異性條帶的Western blot產物各條帶灰度進行定量分析，再按照公式計算相對灰度［相對灰度=(試驗組檢測蛋白的灰度值×對照組β-actin的灰度值)/(對照組檢測蛋白的灰度值 ×該組β-actin的灰度值)］。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，實驗數據以表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模前后各組大鼠生化指標比較 高糖高脂灌胃8周后大鼠存在胰島素抵抗，造模后大鼠血糖水平明顯高于A組(P＜0.05)，且空腹血糖＞16.7 mmol/L，表明模擬2型糖尿病造模成功。B、C、D組血糖、血清TG、TC和LDL-C水平明顯高于A組(P均＜0.05)。C、B組的TC和 LDL-C水平明顯低于D 組(P ＜0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠ROS結果 A組大鼠主動脈原位ROS含量的熒光強度弱，熒光密度較低，能看見組織間隙;D組主動脈原位ROS含量的熒光強度最強，在顯微鏡下其熒光強度刺眼，以內膜及平滑肌層處強度最強，看不見組織間隙，表明其ROS水平4組中最高，且明顯高于A組;B、C組主動脈原位ROS含量熒光強度處于前兩者之間，鏡下可見較強的熒光，表明普羅布考干預治療可以減低糖尿病大鼠主動脈原位ROS水平。

表1 造模前后各組大鼠生化指標比較(mmol/L，)

表1 造模前后各組大鼠生化指標比較(mmol/L，)

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與 D 組造模后比較，△P ＜0.05

組別 n 血糖TG TC HDL-C LDL-C A 組 10 5.64 ±0.61 0.72 ±0.19 2.39 ±0.76 1.10 ±0.37 1.14 ±0.29 B組造模前 13 5.52 ±0.33 2.63 ±1.30 6.88 ±1.53 1.04 ±0.42 4.80 ±1.23造模后 6 28.85 ±6.00* 5.11 ±1.39* 10.15 ±3.19＊△ 1.08 ±0.33 8.34 ±3.15＊△C組造模前 13 5.53 ±0.53 2.63 ±1.01 6.72 ±1.61 0.96 ±0.32 5.28 ±1.29造模后 8 29.91 ±5.68* 5.13 ±1.67* 9.67 ±3.34＊△ 1.00 ±0.27 7.67 ±2.56＊△D組造模前 14 5.51 ±0.53 2.64 ±1.00 6.75 ±1.64 0.97 ±0.34 5.30 ±1.27造模后 7 30.93 ±4.59* 4.83 ±1.05* 14.64 ±3.45* 0.96 ±0.20 12.57 ±3.21*

2.3 LOX-1 mRNA、LOX-1蛋白測定結果 D組大鼠主動脈組織LOX-1 mRNA、LOX-1蛋白表達明顯高于A組，普羅布考干預可以減少糖尿病大鼠主動脈組織的LOX-1 mRNA、LOX-1蛋白水平，而造模前提前給予普羅布考干預不能進一步降低其mRNA及蛋白水平。見表2。

表2 實驗結束時各組大鼠主動脈血管組織LOX-1 mRNA及蛋白表達()

表2 實驗結束時各組大鼠主動脈血管組織LOX-1 mRNA及蛋白表達()

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與 B、C 組比較，△P ＜0.05

組別 n LOX-1 mRNA灰度值 LOX-1蛋白灰度值A組9 0.55 ±0.05 0.69 ±0.05 B 組 6 0.80 ±0.06* 0.79 ±0.06*C 組 8 0.81 ±0.05* 0.81 ±0.05*D 組 7 0.93±0.04＊△ 0.96 ±0.07＊△

3 討論

LOX-1作為一種細胞表面受體，主要發揮對Ox-LDL的胞吞作用，其活化會導致血管內皮細胞的功能紊亂［1］，是動脈粥樣硬化病變的關鍵因素［2］和始動環節。一方面，LOX-1的上調，會導致ox-LDL與LOX-1結合、攝入內皮細胞增加，進一步導致:NF-κB 的激活，內皮細胞功能紊亂［3］;Fas活性增加，內皮細胞的凋亡增加［4］;P-選擇素、VCAM、ICAM的水平上調，單核細胞的黏附增強［5］、向內膜的遷移增強［6］，內皮細胞功能紊亂，泡沫細胞形成，最終形成典型的動脈粥樣硬化斑塊。體內可溶性LOX-1的測定可能有助于對動脈粥樣硬化和血管疾病的評價和預測［7］。另一方面LOX-1活化還誘導基質金屬蛋白酶 (MMP)的表達［8］，其機制是通過P38MAPK 通路來完成的［9］。

本研究中，各組大鼠主動脈原位ROS水平與該處內皮細胞LOX-1基因及蛋白表達水平是平行的，且抗氧化劑普羅布考治療組的主動脈內皮細胞LOX-1基因和蛋白表達水平明顯下降，其進一步證實氧化應激對LOX-1具有重要的調控作用。大量研究亦證實氧化應激在LOX-1的表達中發揮重要作用。研究證明，丙二醛［10］、ROS可以明顯上調人血管內皮細胞LOX-1的表達，LOX-1的表達水平可以在多種病理情況下上調，如高血壓、高血脂［11］，甚至是動脈粥樣硬化本身［12］。在這些病理情況下，脈管系統內高水平的ROS可能是在這些環境下導致LOX-1上調的潛在機制。

本研究顯示，LOX-1在糖尿病大鼠大血管病變早期即已有明顯的高表達，這種高表達可能在大血管的病變中發揮至關重要的作用，其機制可能與糖尿病大血管處的原位ROS有關，并且抗氧化治療可能是糖尿病大血管病變的一個新的有效手段。但是，糖尿病環境下ROS/LOX-1通路還有哪些中間環節，有待在以后的研究中進一步明確。

［1］Wang LJ，Yu YH，Zhang LG，et al.Taurine rescues vascular endothelial dysfunction in streptozocin-induced diabetic rats:Correlated with downregulation of LOX-1 and ICAM-1 expression on aortas［J］.European Journal of Pharmacology，2008，597(1):75-80.

［2］莊世虹，成蓓，何運橋，等.LOX-1在2型糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥中的表達及其作用［J］.微循環學雜志，2010，20(2):20-22.

［3］Halvorsen B，Staff AC，Henriksen T，et al.8-iso-Prostaglandin F2 increases expression of LOX-1 inJAR cells［J］.Hypertension，2001，37(4):1184-1190.

［4］Chen J，Mehta JL，Haider N，et al.Role of caspases in Ox-LDL-induced apoptotic cascade in human coronary artery endothelial cells［J］.Circ Res，2004，94(3):370-376.

［5］Chen M，Masaki T，Sawamura T.LOX-1，the receptor for oxidized low-density lipoprotein identified from endothelial cells:implication in endothelial dysfunction and atherosclerosis［J］.Pharmacol Ther，2002，95(1):89-100.

［6］Li D，Mehta JL.Antisense to LOX-1 inhibits oxidized LDL-mediated upregulation of monocyte chemoattractant protein-1 and monocyte adhesion to human coronary artery endothelial cells［J］.Circulation，2000，101(25):2889-2895.

［7］Kume N，Mitsuoka H，Hayashidam K，et al.Soluble lectin-Like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 predicts prognosis after acute coronary syndrome—a pilot study［J］.Circ J，2010，74(7):1399-1404.

［8］Li DY，Liu L，Chen HJ，et al.LOX-1 mediates oxidized low-density lipoprotein induced expression of matrix metalloproteinase in human coronary artery endothelial cells［J］.Circulation，2003，107(4):612-617.

［9］Mehta JL，Chen J，Yu F，et al.Aspirin inhibits ox-LDL-mediated LOX-1 expression and metalloproteinase-1 in human coronary endothelial cells［J］.Cardiovasc Res，2004，64(2):243-249.

［10］Sankaralingam S，Xu H，Jiang Y，et al.Evidence for increased methylglyoxal in the vasculature of women with preeclampsia role in upregulation of LOX-1 and arginase［J］.Hypertension，2009，54(4):897-904.

［11］Chen M，Kakutani M，Minami M，et al.Increased expressionof lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1 ininitial atherosclerotic lesions of watanabe heritable hyperlipidemicrabbits［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20(4):1107-1115.

［12］Kataoka H，Kume N，Miyamoto S，et al.Expression of lectinlike oxidized low-density lipoproteinreceptor-1 in human atherosclerotic lesions［J］.Circulation，1999，99(24):3110-3117.