Livin在視網膜母細胞瘤組織中的表達及臨床意義

張 萌，袁乃芬，劉 巍

(河北醫科大學第四醫院，石家莊 050011)

視網膜母細胞瘤(RB)是兒童常見的眼內原發惡性腫瘤，嚴重威脅患兒的視力和生命。凋亡抑制蛋白(Livin)是2000年由科學家在人基因組庫中篩選克隆出的一種新型、有較強抗凋亡功能的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族新成員，能夠與凋亡蛋白酶結合，抑制其介導的細胞凋亡［1，2］。2000年1月 ～2010年12月，我們采用Max-VisionTM快捷免疫組化法檢測RB中Livin的表達情況，旨在進一步了解其在RB發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇我院手術切除的RB組織標本43份(腫瘤組)，其中男23例，女20例;年齡9個月～8歲，平均3.35歲。所有患兒均經病理證實，且術前均未進行放化療。按傳統臨床分期，眼內生長期21例，青光眼期13例，眼外擴展期9例;按照組織病理學分型，未分化型24例，分化型19例。另選外傷后眼球摘除的正常組織標本6份(正常組)，兩組一般資料無統計學差異。主要試劑:兔抗人Livin多克隆抗體購自北京博奧森公司(bs-0738R)。主要儀器:Leica RM2135型切片機、Olympus BX41顯微鏡、Qcapture圖像采集系統(加拿大Qimaging公司)。

1.2 Livin表達檢測 所有標本均經甲醛固定，自動脫水，浸蠟，包埋，切片。蘇木素—伊紅(HE)染色按常規進行。免疫組化采用Max-VisionTM快捷免疫組化法。石蠟切片脫蠟和水化后，PBS(pH 7.4)沖洗3次，抗原修復后，3%過氧化氫室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化酶的活性，PBS沖洗3次，加入工作濃度1∶300的Livin抗體室溫孵育2～3 h，PBS沖洗3次，加入二抗，室溫下孵育20 min，PBS沖洗，最后DAB顯色，中止反應后蘇木素復染，脫水、透明、封片。以已知的陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。陽性判定標準:Livin表達主要位于細胞質，以出現清晰的棕黃色顆粒作為陽性結果判定。每張切片隨機選取10個不同高倍視野各計數100個細胞，按陽性細胞所占的百分比計分:≤5%計0分，6% ～25%計1分，26% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分;著色強度依據著色計分:無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕褐色為3分。上述兩項相加＜2分為陰性，＞2分為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Livin表達情況 兩組Livin陽性表達率分別為62.79%、0，P ＜0.05。

2.2 Livin表達與RB臨床病理特征的關系 見表1。

表1 Livin表達與RB臨床病理特征的關系

3 討論

惡性腫瘤的發生不僅與癌基因的激活和抑癌基因的突變或缺失有關，還與腫瘤凋亡的抑制有關。凋亡抑制是腫瘤細胞的一個重要特性，與腫瘤細胞無限增殖密切相關。IAPs是目前發現的惟一可以與半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)直接結合而起抑制作用的蛋白家族，其過度表達引起的凋亡不足與腫瘤發生密切相關。Livin又名KIAP/ML-IAP，2000年在人基因組庫中篩選克隆出的一種新型、有較強抗凋亡功能的IAPs蛋白家族新成員。Livin基因定位于染色體20q13，全長4.6 kb，包含7個外顯子及6個內含子，其基因轉錄產物有兩種mRNA亞型，分別編碼298個氨基酸蛋白質(α)和280個氨基酸蛋白質(β)，Livin蛋白N端包含1個BIR結構，C端含1個 RING環指結構［3］。研究發現，Livin在黑色素瘤、結腸癌、前列腺癌和膀胱癌等腫瘤細胞中及胎盤、胚胎組織中表達，但在多數正常成人組織中不表達。這一表達的特異性使Livin基因成為目前國際研究的熱點［4］。

Livin的高表達可能與腫瘤的形成和細胞增殖活躍密切相關［5］。本研究腫瘤組Livin陽性表達率明顯高于正常組，提示Livin的高表達可能與RB的發生、發展有關。本研究發現Livin陽性表達與RB的組織分化程度有關，提示Livin的陽性表達不但與RB的發生有關，還可能與RB的惡性程度呈正相關，可能是預后不良的指征。可能機制:Livin的BIR區與Caspase結合，抑制Caspase活性，尤其是抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性，從而阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎的凋亡途徑［6，7］。本研究還發現Livin陽性表達與RB臨床分期無明顯相關性，表明Livin表達可能與腫瘤的局部浸潤生長無明顯相關性，也可能因為本研究病例數較少，有待于大樣本的研究做進一步評價。

總之，Livin表達上調在RB的發生、發展中起促進作用，可作為RB早期診斷及預后的指標之一，為RB的基因治療提供新靶點。

［1］Hariu H，Hirohashi Y，Torigoe T，et al.Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family，Livin/ML-IAP in lung cancer［J］.Clinical Cancer Research，2005，11(3):1000-1009.

［2］Vucic D，Deshayes K，Ackerly H，et al.SMAC negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(MLIAP)［J］.J Biol Chem，2002，277(14):12275-12279.

［3］Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern［J］.FEBS Lett，2001，495(1-2):56-60.

［4］Gazzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of livin，survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer［J］.Ann Oncol，2003，14(1):85-90.

［5］Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of anti-Livin antibody in gastrointestinal cancer patients［J］.Clin Chem，2003，49(7):1206-1208.

［6］Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］.Curr Biol，2000，10(21):1359-1366.

［7］Kasof GM，Gomes BC.Livin a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］.J Biol Chem，2001，276(5):3238-3246.