巨細胞病毒感染對大鼠肝移植慢性排斥反應的致病機制探討

陳海鳴，王 英，萬仁華，鄒志森，單人鋒，高良輝*

(1南昌大學第一附屬醫院，南昌 330006;2江西省電力職業技術學院)

肝臟移植是終末期肝病的惟一有效治療方法，慢性排斥反應(CR)是移植肝功能喪失的重要原因。研究發現，巨細胞病毒(CMV)感染是CR發生的危險因素之一。2007年1月～2009年12月，我們觀察CMV感染的肝移植受體大鼠慢性排斥反應的發生情況及纖維增生因子轉化生長因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生長因子(PDGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達，初步探討CMV感染對慢性排斥反應的致病機制。

1 材料與方法

1.1 CMV感染模型制作及干預 肝移植受體大鼠(為近交系DA雄性大鼠)84只，體質量250～350 g，均在標準條件下飼養。按隨機化原則分為實驗組和對照組各42只，肝臟移植術后當天至移植后30 d皮下注射CsA 1 mg/(kg·d)。實驗組移植當天腹腔注射人巨細胞病毒(HCMV，浙江大學第一附屬醫院血液病研究所饋贈［1］)0.4 ml，對照組腹腔注射生理鹽水0.4 ml。兩組均于移植術后0、1、2 d肌肉注射氨芐青霉素200 mg/(kg·d)。

1.2 相關指標觀察 兩組均于肝移植后1、6、10、20、30、60 d各處死6只大鼠，采集移植肝臟及血清觀察以下指標。

1.2.1 肝組織病理學變化 取肝組織制作切片，常規HE染色、Masson三色染色，參考Gao等［2］方法觀察肝組織病理學變化。

1.2.2 排斥反應活動指數(RAI) 對移植肝臟、膽管炎性損傷、阻塞性動脈病變及纖維化按程度輕重計算RAI。①膽管炎性損傷:損傷為0分;少數膽管被炎癥細胞圍繞，上皮細胞有核/漿比例增加等輕度反應為1分;多數或全部膽管有炎癥細胞浸潤，上皮細胞呈核多形性、極性改變，胞質空泡化等退行性改變略多為2分;上述兩項伴有退行性變和局灶性管腔破壞明顯，或部分膽管結構完全破壞為3分。②肝動脈阻塞性病變:正常動脈為0分;內膜增生或細胞浸潤、動脈管腔縮小＜10%原管腔為1分;動脈管壁增厚、10%≤管腔縮小＜50%為2分;動脈因阻塞性動脈病變或纖維化，動脈管腔縮小≥50%原管腔或完全閉塞為3分。③肝纖維化:無纖維化為0分;匯管區纖維化，小葉間無纖維間隔形成為1分;匯管區纖維化，小葉間不完全的纖維間隔形成為2分;匯管區纖維化，小葉間完全的纖維間隔形成為3分;廣泛纖維化形成，彌散性肝硬化為4分。三項RAI相加為總RAI(ORAI)。

1.2.3 肝組織 TGF-β1、PDGF、bFGF mRNA 表達檢測 取冰凍肝組織30 mg。Trizol法提取RNA，逆轉錄cDNA，冰上行PCR反應，凝膠電泳30 min，攝影，采用RT-PCR檢測各指標mRNA表達情況。

1.2.4 血清 TGF-β1、PDGF、bFGF 表達檢測 取血清0.1 ml，采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明操作。

1.3 生存期 除處死大鼠外，對每組所剩6只，采用Kaplan-Meier法計算生存期。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件，所得數據以表示，生存率比較以Kaplan-Meier法檢驗，組間比較用單因素方差分析One-way ANOVA，選擇LSD或Bonfferroni/Dunne t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 病理學變化 兩組均顯示移植肝進行性加重的慢性排斥反應，表現為中度到重度的泡沫細胞阻塞性動脈病變、膽管損傷或消失、細胞浸潤和肝纖維化。取材時間越接近臨終期，病變特點越典型。

2.2 RAI ①膽管炎性損傷:肝移植后20 d內兩組RAI無顯著差異;實驗組及對照組移植后30 d RAI分別為2.17 ±0.98、1.33 ±0.52，P ＜0.01。即實驗組膽管損傷發生早于對照組。②肝動脈阻塞性病變:肝移植后20 d內兩組無顯著差別。移植30 d對照組、實驗組 RAI分別為 1.33±0.52和 2.50±0.55，P ＜0.01。但對照組30 d、實驗組20 d 和對照組60 d、實驗組30 d相比無統計學意義，說明實驗組動脈阻塞性病變出現的時間早。③肝臟纖維化:對照組和實驗組肝移植后20 d肝纖維化RAI分別為1.0 ±0.63、1.67 ±0.52，P ＜0.05;30 d 分別為2.67 ±0.52、3.17 ±0.75，P ＜0.05;即實驗組肝纖維化明顯重于對照組。兩組不同時點ORAI見表1。

表1 兩組不同時間總排斥反應活動指數比較()

表1 兩組不同時間總排斥反應活動指數比較()

注:與對照組比較，*P ＜0.01

組別10 d 20 d 30 d實驗組 2.83 ±1.33 5.17 ±1.47* 7.17 ±1.47*對照組3.00 ±1.33 8.00 ±1.67 10.83 ±2.32

2.3 移植肝 TGF-β1、PDGF、bFGF mRNA 表達 見圖1。

2.4 外周血 TGF-β1、PDGF、bFGF表達 見圖2。

圖1 兩組肝組織TGF-β1、PDGF、bFGF mRNA表達

圖2 兩組血清TGF-β1、PDGF、bFGF表達

2.5 生存期比較 實驗組和對照組生存期分別為(41.13 ±12.45)、(58 ±14.93)d，兩組比較 P ＞0.05。

3 討論

據報道，肝臟移植后HCMV的感染率為30% ～65%，可引起膽管消失，膽管萎縮及動脈阻塞性病變。其中18%～40%的患者出現臨床癥狀，發病高峰期為移植后第1～3個月。有關HCMV感染與肝臟移植慢性排斥反應的關系目前尚無明確定論。Lautenschlager等［3］報道，10例肝臟移植后因慢性排斥反應導致移植物無功能者均有HCMV感染史;原位雜交檢測所有移植物持續表達CMV-DNA，在剩余的膽管中有強表達，血管內皮細胞中有中等程度的表達。Arnold等研究證實，膽管消失綜合征與持續HCMV感染有關。說明HCMV感染是慢性排斥反應的危險因子之一。本研究兩組生存期無統計學差異，但實驗組移植后20、30 d總RAI均顯著高于對照組，說明HCMV感染加劇了慢性排斥反應的程度，加速了其進程。組織病理學半定量分析進一步支持該結果:實驗組膽管損傷的出現顯著早于對照組，動脈阻塞性病變明顯重于和早于對照組，肝臟纖維化程度亦呈現同樣趨勢。

Michelson等［4］發現，HCMV 的 IE 蛋白可激活TGF-β1啟動子，5 ～9 h 后 TGF-β1基因轉錄激活，導致HCMV感染早期TGF-β1mRNA水平升高。本研究實驗組肝組織及血清TGF-β1表達水平均無明顯升高，且與對照組無明顯差異，說明HCMV感染加劇和加速慢性排斥反應時纖維化程度與TGF-β1表達水平無關。

PDGF是有絲分裂促進劑，能使間充質細胞轉化成肌成纖維細胞，促使平滑肌細胞遷移與增生導致動脈粥樣硬化、血管狹窄和慢性排斥;PDGF及其受體在心臟、腎臟和肺慢性排斥反應的血管病變中起關鍵作用［5～7］。本研究顯示，慢性排斥反應時發生早期(10 d以內)實驗組肝組織及血清PDFG表達升高，6～20 d時均明顯高于對照組;慢性排斥反應晚期(60 d)兩組PDFG表達無明顯差異，提示PDFG表達升高可能參與了早期慢性排斥反應的形成。

bFGF是一多效細胞因子，在組織修復中起重要作用，可刺激血管平滑肌細胞增生、血管新生、細胞外基質積聚和神經元增生。Garrett等體外實驗證實，HCMV在成纖維細胞中培養可使bFGF的表達轉向高相對分子質量形式。Koskinen等發現，在大鼠心臟慢性排斥反應中，bFGF表達增多、炎癥反應加重，導致血管新生和纖維化。本研究顯示，慢性排斥反應時肝組織和血清bFGF均呈持續上升表達，實驗組bFGF mRNA表達水平自20 d開始明顯高于對照組，提示HCMV感染可增加bFGF mRNA表達水平，加速移植肝纖維化和慢性排斥反應進程。

總之，CMV感染能加劇慢性排斥反應泡沫細胞阻塞性動脈病變和肝臟纖維化病變的程度，加快慢性排斥反應的進程，其致病機制可能與增加PDGF和bFGF表達相關。

［1］Gao L，Qian S，Zeng L，et al.An animal model of human cytomegalovirus infection［J］.Transplant Proc，2007，39(10):3438-3443.

［2］Gao LH，Zheng SS，Zhu YF，et al.A rat model of chronic allograft liver rejection［J］.Transplant Proc，2005，37(5):2327-2332.

［3］Lautenschlager I，Hockerstedt K，Jalanko H，et al.Persistent cytomegalovirus in liver allografts with chronic rejection［J］.Heratology，1997，25(1):190-194.

［4］Michelson S，Alcami J，Kim SJ，et al.Human cytomegalovirus infection induces transcription and secretion of transforming growth factor beta 1［J］.J Virol，1994，68(9):5730-5737.

［5］Mancini MC，Evans JT.Role of platelet-derived growth factor in allograft vasculopathy［J］.Ann Surg，2000，231(5):682-688.

［6］Lemstrom KB，Koskinen PK.Expression and localization of plateletderived growth factor ligand and receptor protein during acute and chronic rejection of rat cardiac allografts［J］.Circulation，1997，96(4):1240-1249.

［7］Kallio EA，Koskinen PK，Aavik E，et al.Role of platelet-derived growth factor in obliterative bronchiolitis(chronic rejection)in the rat［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999，160(4):1324-1332.