枯草芽孢桿菌發酵產物殺蟲作用的研究

余 瓊 ，張 巍 ，楊旭升 ，杜 陽

（1.黑龍江大學生命科學學院微生物學重點實驗室，黑龍江哈爾濱150080；2.黑龍江省科學院，黑龍江哈爾濱150001）

目前，植物病害防治主要依賴化學農藥，化學農藥在農產品的安全生產中做出了巨大貢獻[1]，但化學農藥的普遍使用和農藥用量的增加產生了一系列問題，如病原菌產生抗藥性、農產品農藥殘留超標，農田生態環境污染等問題。這些問題增加了農田生產成本，同時也使本身具有優良品質的農產品因農藥的過度使用而受影響。新的防治技術和病害防治手段成為植保科技工作者探索的方向，其中利用枯草芽孢桿菌防治植物病害成為研究熱點[2]。枯草芽孢桿菌是一種有益的土壤細菌，具有發達的分泌系統和較強的環境適應性，在農業生產中被廣泛應用。枯草芽孢桿菌對多種病原菌具有拮抗性能，生產中用于防治多種植物病害[3-5]。例如用來防治芒果軟腐病、辣椒炭疽病、蘋果輪紋病、水稻紋枯病、水稻白葉枯病和一些鐮刀菌引起的病害，相關研究比較深入，取得了顯著的研究進展[6-10]。

由于生防微生物在田間條件下易受土壤溫濕度、pH值、作物生長狀況及土壤生態系統等微環境因素的影響，防治效果不穩定，用于大面積推廣應用風險太大。因此，大多數枯草芽孢桿菌的生防研究總體上還處于實驗室階段[11-16]。為了解決這一問題，目前主要采用與化學農藥復配防病和與其他拮抗微生物協同防病這兩種措施。

與化學農藥復配防病是通過使用化學藥劑來幫助枯草芽孢桿菌克服在土壤生態環境里定殖的過程中與其它微生物群落競爭，從而形成優勢種群，使之有足夠的群體數量來克服包括病原菌在內的土壤習居微生物的排斥，保持其在植物根、葉周圍定殖、分泌抗生素、誘導植物抗病性等作用，同時發揮化學藥劑殺蟲抑菌速度快、防治效果穩定的優勢，通過復配協同作用達到優勢互補、用量減少、防效增強的目的[16-21]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和蟲源

枯草芽孢桿菌由本實驗室分離保存。

供試的蟲種為菜青蟲，黑龍江省科學院生物肥料研究中心室內常年累代飼養多代敏感蟲種。

1.2 培養基

斜面培養基：LB培養基（蛋白胨10%，酵母浸粉5%，NaCl 5%，蒸餾水，pH值自然）。

種子培養基:蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1%，自然pH值。

發酵培養基:蔗糖1%，蛋白胨1%,磷酸氫二鈉0.2%，磷酸二氫鈉0.2%，pH 7.0。

1.3 菌種活化

將保存的菌種轉接到斜面培養基，37℃培養24h，備用。

1.4 種子液的制備

取一環活化的菌種，接入裝量為50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，37℃，180 r/min培養18h。

1.5 搖瓶培養

取1 mL種子液，接入盛有50 mL發酵培養基的200mL三角瓶中（接種量為2%,V/V）。置搖床中，30℃振蕩培養12h，轉速為160 r/min，進行發酵。

1.6 枯草芽孢桿菌生長曲線的測定

取培養好的斜面，用接種環挑3環接種于盛有50mL無菌種子培養基的250mL三角瓶中，采用搖瓶發酵培養條件振蕩培養24h。自接種后每2h取樣1次測定菌液的OD(600 nm),用未接種的培養基作為空白對照。

1.7 殺蟲活性物質的酸堿穩定性測定

取發酵液10 mL進行殺蟲實驗，再用稀HCl或稀NaOH將其 pH值調至 2.0，3.5，4.0，5.0，6.5，8.0，9.5，11.0，靜置24 h后，再調pH值為原發酵液的pH值6.8后，進行殺蟲活性測定。

2 結果與分析

2.1 生長曲線的測定

生長曲線圖見1，發酵培養0～2 h為枯草芽孢桿菌的生長停滯期，細菌數量極少;自2h以后進入對數生長期，菌體數量急劇增多;在12h達到生長高峰期，8～12h為枯草芽孢桿菌生長的穩定期，菌體生長緩慢。自12h后細菌數量開始減少，枯草芽孢桿菌進入生長衰亡期。因此，采用8～12h時的菌液作為菌種較合適，此時枯草芽孢桿菌為對數生長末期，既可保持高的細胞活力，又可獲得盡可能多的細胞數。

圖1 枯草芽孢桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

2.2 殺蟲活性物質的酸堿穩定性

枯草芽孢桿菌發酵液在pH值為2.0～11.0的條件下處理24 h后，進行殺蟲性試驗，試驗結果見表1。

表1 發酵液經過不同pH值條件下處理后的殺蟲活性對比表Table 1 Comparison of insecticidal activity of broth on different pH valueconditions

2.3 討論

研究結果表明，枯草芽孢桿菌的殺蟲作用主要有兩種方式，一是造成細胞畸形，出現囊泡、腫脹，繼而崩潰融解。二是對細胞壁的破壞，造成原生質從細胞壁融解處泄漏，以至消融。

3 結 論

通過實驗可以得出枯草芽孢桿菌在不同的時間處在不同的生長時期，經實驗分析得出枯草芽孢桿菌在8～12h為生長的穩定期，菌體生長緩慢。自12h后細菌數量開始減少，枯草芽孢桿菌進入生長衰亡期。因此，采用8～12 h時的菌液作為菌種較合適，此時枯草芽孢桿菌為對數生長末期，既可保持高的細胞活力，又可獲得盡可能多的細胞數。

通過實驗可以得出經不同的pH條件處理后，枯草芽孢桿菌發酵液的殺蟲活性在64.7%～73.8%之間波動，整體波動不大；在pH 3.5～8.0的范圍內，枯草芽孢桿菌發酵液的殺蟲活性穩定在70%以上，在pH2.0、9.5及11.0處理后菜青蟲的死亡率有所下降，但與原發酵提取液相比，仍保留原發酵液80%左右活性。說明該殺蟲活性物質具有較好的pH值穩定性。

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