HPLC法定量分析水中光合細菌菌體產量

趙 微，張光明

(哈爾濱工業大學 市政環境工程學院，150090哈爾濱，gmgwen@gmail.com)

光合細菌(Photosynthetic bacteria，PSB)是一類以光作為能源、能在光照厭氧或黑暗好氧條件下利用有機物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進行光合作用的微生物.PSB能有效處理高濃度有機廢水[1]，對淀粉、豆制品加工[2]、啤酒廠[3]、油脂工業等工業廢水及生活污水，處理效果好，對COD的去除率達到60% ～95%，且PSB菌體本身含有豐富的營養物質和生理活性物質[4]，能夠作為肥料、飼料、餌料[5]回收利用，在處理廢水的同時可實現污水資源化.然而，由于廢水中各種干擾物質的存在，使得廢水中PSB菌體產量的準確測量存在問題.

在純培養條件下PSB的定量檢測方法包括顯微鏡直接計數法、平板計數法、紫外分光光度法與可見分光光度法、HPLC法等.顯微鏡直接計數法隨機性大，不能宏觀、全面地反應菌體數量，在廢水處理中一般不采用該方法.平板計數法計數周期長、方法復雜，在廢水處理中一般也不采用該方法.紫外分光光度法與可見分光光度法受廢水中雜質影響較大，尤其是受色度的影響，因此這2種方法不適合檢測帶有濁度或色度的廢水.HPLC法雖然方法簡便易行、精確、不受廢水中雜質影響，但不能將PSB作為直接檢測物來分析.吳祖芳等的研究[6]表明，PSB 中含有一種特征物質 CoQ10[7](CoQ10又稱泛醌，化學名稱為2，3－二甲氧基－5－甲基－6－癸異戊烯基－1，4－苯醌).其在PSB中含量較高且相對穩定，可以用它的含量來定量表征PSB的菌體產量.目前CoQ10的檢測方法包括紫外分光光度法、可見分光光度法、HPLC法等.同樣由于廢水中雜質的干擾，導致不能使用分光光度法分析CoQ10的質量.可選的檢測方法只有HPLC法，目前測定廢水中PSB內CoQ10質量的HPLC方法，國內外未見報道.因此本文研究采用HPLC法分析CoQ10的含量以表征廢水中PSB的菌體含量，排除各種干擾因素，擬建立定量分析廢水中PSB菌體產量的方法，以期為PSB在廢水中的檢驗與定量分析提供科學依據.

1 試驗

1.1 材料

試驗所采用的光合細菌為球形紅假單胞菌(Rp.sphaeroids)，購于中科院微生物研究所.試驗采用活性污泥模擬廢水中各雜菌，污泥取至處理生活污水A/O工藝的二沉池.試驗廢水采用濁度較大，有機物質含量較多的人工配水來模擬大豆廢水.試驗儀器與藥品:冰箱(BCD－216ST，Haier);超聲波清洗器(HS3120，BENCHTOPCLEANERS);高效液相色譜(Agilent 1200，Agilent Technologies，Inc.).CoQ10標準品(Sigma 公司生產);甲醇、無水乙醇、乙腈、丙酮均為色譜純.

1.2 方法

CoQ10標準樣品的制備:取 CoQ10標準樣品30 mg，加入無水乙醇40 mL，在50℃水浴中震蕩溶解.放冷后，轉移至100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度搖勻，作為標準品母液，將母液分別稀釋為 3.0、2.5、2.0、1.5、1.0 mg/L.所有樣品均經0.45 μm膜過濾待用.

純培養基中CoQ10的提取方法:取2.5 mL發酵液在11 000 r/min的條件下離心10 min，分離上清和菌體.菌體用去離子水洗至中性，得到菌體細胞待用.CoQ10的提取采用凍融輔助超聲法[8]，將菌體細胞放入冰箱冷凍區冷凍24 h后提取溶劑.樣品均經0.45 μm膜過濾后取上清液進行HPLC分析.雜質中CoQ10的提取方法為:分別取7 200 mg/L的大豆廢水、160 mg/L的 PSB、7 200 mg/L的大豆廢水加 160 mg/L的 PSB，CoQ10的提取方法同上.雜菌中CoQ10的提取方法:取2.5 mL質量濃度為10 000 mg/L的活性污泥，在11 000 r/min的條件下離心10 min，分離上清和菌體.菌體用去離子水洗至中性，得到菌體細胞，CoQ10的提取方法同上.不同培養條件CoQ10的提取方法:將PSB在純培養基中純培養7 d，光照－溶解氧條件分別為光照－厭氧、黑暗－好氧、自然光－微好氧.分別取不同培養條件的發酵液2.5 mL，CoQ10的提取方法同上.不同生長時期CoQ10的提取方法:將PSB在純培養基中培養，光照－溶解氧條件為自然光－微好氧.分別在第24、48、72、96 h 取發酵液 2.5 mL，CoQ10的提取方法同上.安靜等研究[9]表明PSB生長前36 h為延滯期，36～72 h為生長期，從72 h開始進入穩定期，96 h以后細胞進入衰亡期.加樣回收率試驗方法:采用外標加樣回收法，取已知含量的CoQ10樣品5份，精密稱定，分別置具塞的錐形瓶中，加同量的廢水 (7 200 mg/L)、PSB(160 mg/L)，CoQ10的提取方法同上.

2 結果與討論

2.1 色譜條件

流動相的選擇:選用的色譜柱為Sphherisorb C18(10 cm×4.6 mm ID)柱，柱溫35℃，紫外檢測波長275 nm，進樣量15 μL.流動相分別為甲醇和水、甲醇和乙腈、無水乙醇和水、甲醇和無水乙醇.當流動相為甲醇和水時，檢測不到CoQ10標準品.當流動相為甲醇和乙腈時，兩者任意比例關系下，色譜峰或者不出峰，或者峰型不對稱.當流動相為無水乙醇和水時，由于無水乙醇粘度大，CoQ10標準品的保留時間長，柱壓特別高.當流動相為甲醇和無水乙醇時，色譜峰峰型對稱出峰較好，因此對甲醇與無水乙醇的比例進行深入研究.分別配制甲醇與無水乙醇的體積比為1∶1、3∶2、4∶1、9∶1進行實驗，隨著流動相甲醇比例的增加CoQ10標準品的保留時間縮短，當甲醇和無水乙醇比例為3∶2時，在28.773 min出峰，當兩者比例為4∶1時，在23.257 min處出峰，當兩者比例為9∶1時，在21.183 min處出峰.綜合比較后發現，不同比例甲醇與無水乙醇為流動相時峰型都很好，出峰時間選擇甲醇與無水乙醇的比例為9∶1.

流速的選擇:當流速為0.6 mL/min時，CoQ10標準品的保留時間超過35 min，保留時間過長.當流速為 1.5 mL/min時，柱壓過高.當流速為1 mL/min時，CoQ10標準品的保留時間21.183 min，柱壓16.4 MPa.綜合比較，選擇流速為1 mL/min.

綜合上述結果，本文提出的色譜條件:色譜柱為 SphherisorbC18(10 cm×4.6 mm ID)柱;甲醇與無水乙醇(體積比9∶1)為流動相;流速為1 mL/min;柱溫為 35℃;紫外檢測波長為275 nm;進樣量為 15 μL;柱壓為 16.4 MPa.在此條件下，色譜出峰快、峰型良好.采用如上確立的HPLC檢測方法，獲得CoQ10標準品譜圖與標準曲線分別見圖1與圖2，由圖可見，CoQ10標準品的保留時間為21.183 min，CoQ10標準品密度與峰面積具有良好的相關性.

圖1 CoQ10標準品HPLC色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

圖2 CoQ10標準曲線

由于CoQ10為細胞內物質，其提取效果的好壞直接關系到產品的收率，許芳等研究表明采用乙醇與丙酮對PSB中CoQ10提取效果較好.本文對菌體細胞分別采用:1)無水乙醇提取5 h;2)丙酮提取5 h;3)丙酮提取5 h后，揮發去除全部丙酮，用無水乙醇溶解.不同提取溶劑對CoQ10提取率的影響見圖3，可見，先用丙酮提取5 h后，揮發掉全部丙酮，再用無水乙醇溶解，這一提取方法相對提取率最高.

圖3 不同溶劑對CoQ10提取率的影響

2.3 外標加樣回收率及檢測限實驗

采用上述確立的檢測方法及提取方法，并進行外標加樣實驗，加樣回收率見表1.平均回收率為99.13%，相對標準偏差為0.81%(n=5).實驗表明，上述方法精密度高，重復性好，可用于CoQ10的提取與檢測.

表1 加樣回收率(n=5)

表2樣品中CoQ10質量檢測限試驗可見，當CoQ10質量濃度低于9.6 mg/L時，檢測結果出現很大的偏差，當CoQ10質量濃度高于22.4 mg/L時，由于質量濃度過高也出現很大的偏差，可重復性差，因此對 CoQ10質量濃度的檢測限為9.6～22.4 mg/L.當CoQ10質量濃度低于3.2 mg/L時，應先濃縮再進行檢測，當 CoQ10質量濃度高于22.4 mg/L時，應先稀釋再進行檢測.

2.4 不同培養條件與培養時期對PSB內CoQ10質量的影響

PSB內CoQ10的含量是否穩定將直接關系到檢測方法的可行性.PSB培養條件光照－溶解氧組合的不同可能導致PSB代謝類型不同，不同代謝類型的PSB內 CoQ10的質量可能不同[10].同一種微生物在不同的生長時期，由于細胞代謝活力、對不良條件的抵御能力、菌體體積的不同可能引起CoQ10含量不同.不同培養條件及培養時期PSB內CoQ10質量的研究見圖4和圖5.

表2 檢測限試驗

圖4 不同培養條件每克烘干后PSB內CoQ10的質量

由圖4可見，黑暗－好氧、光照－厭氧、自然光－微好氧條件下，每克烘干后PSB內CoQ10的質量分別為(41.2±1.7)、(41.6±1.3)、(41.3±2.3)mg，不同培養條件下每克烘干后的PSB內CoQ10的質量穩定.

圖5 不同培養時期每克烘干后PSB內CoQ10的質量

由圖5可見，在不同培養時期遲緩期、穩定期、對數期、衰亡期每克烘干后PSB內CoQ10的質量分別為(39.8±1.4)、(41.4±2.0)、(40.3±1.8)、(40.1±1.9)mg.不同培養時期每克烘干后PSB內CoQ10的質量穩定.

2.5 廢水中干擾因素對PSB內CoQ10質量的影響

廢水中的糖類、蛋白質、脂類等雜質的存在可能干擾CoQ10的檢測.處理污水過程中不可避免地會感染雜菌，雜菌的菌群中可能含有PSB，因此雜菌的存在也可能干擾CoQ10的檢測.廢水中干擾因素的研究見圖6和圖7.

圖6 發酵液、大豆廢水、發酵液+大豆廢水中每克烘干后PSB內CoQ10的質量

由圖6可見，發酵液、大豆廢水、發酵液+大豆廢水中每克烘干后PSB內CoQ10的質量分別為(41.5 ±1.5)、0、(40.3 ±1.9)mg.廢水本身不含有PSB，廢水中雜質的存在不干擾CoQ10的檢測.

圖7 發酵液、雜菌、發酵液+雜菌中每克烘干后PSB內CoQ10的質量

由圖7可見，發酵液、雜菌、發酵液+雜菌中每克烘干后PSB內CoQ10的質量分別為(41.5±2.1)、(61.2 ± 0.01)、(41.0 ±1.7)mg.雜菌中CoQ10的含量十分的少，與廢水中PSB內CoQ10的質量不在同一數量級上，因此雜菌的存在不干擾CoQ10的檢測.

由圖4～7可見，不同培養條件及培養時期的PSB內CoQ10質量分數非常穩定，廢水中的雜質以及雜菌等干擾因素均不影響CoQ10的檢測.表明本方法可用于水及廢水中CoQ10質量的檢測，從而可用于分析水及廢水中PSB的產量.

2.6 PSB菌體產量的換算

由圖1可知，CoQ10質量濃度與峰面積關系為

由圖 4和圖 5可知，CoQ10質量分數為4.08%.

由式(1)、(2)可得，峰面積與PSB質量濃度的關系為

其中:X為CoQ10的質量濃度，g/L;Y為峰面積，V·s;R2=0.984 8).

CoQ10質量分數為

3 結論

1)利用HPLC法分析水與廢水中CoQ10的質量來定量表征PSB的產量，建立了一個定量表征水及廢水中PSB含量的方法.提出色譜條件為:色譜柱為 SphherisorbC18(10 cm×4.6 mm ID)柱;甲醇與無水乙醇為流動相，體積比9∶1;流速為1 mL/min;柱溫35℃;紫外檢測波長275 nm;進樣量 15 μL;柱壓 16.4 MPa.

2)先用丙酮提取5 h后揮掉全部丙酮再用無水乙醇溶解這一提取方法對CoQ10的相對提取率最高.平均回收率為99.13%，相對標準偏差為0.81%(n=5).不同培養條件及培養時期PSB內CoQ10的含量十分穩定.廢水中雜質、雜菌等干擾因素均不影響檢測結果.

3)PSB質量濃度為(Y+37.487)/25.431 g/L，其中Y為峰面積，V·s，可用上述方法定量分析水中PSB的菌體產量.

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