高甘油三酯血清對人臍靜脈內皮細胞的損傷作用

居峰 吳劍吳文宏周曉霞

（1江蘇省靖江市人民醫院，江蘇 靖江 214500；2揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225001）

近年來，心腦血管疾病己成為當今世界上威脅人類健康最嚴重的疾病之一，其中動脈粥樣硬化（arteriosclerosis，AS）的發病率和死亡率位居前列。血管內皮細胞損傷導致的內皮功能障礙不僅是AS的一個始動環節，還是導致其不斷進展的重要因素。因此，改善和恢復血管內皮功能已經成為AS防治的重要目標之一。

在眾多導致AS的危險因素中，高甘油三酯血癥（HTG）與AS的關系則一直頗有爭議。近年來，國內外一些新的流行病學研究資料及病理學研究表明，HTG是AS發生的獨立危險因素并在AS斑塊中發現有富含甘油三酯脂蛋白的類似物存在[1]。然而，在細胞水平上，高甘油三酯血清（High triglyceride blood serum，HTGBS）是否可直接導致血管內皮細胞的氧化損傷的相關研究報道甚少，故本研究采用體外培養人臍靜脈內皮細胞（human vascular endothelial cell，HUVEC），觀察單純HTGBS對血管內皮細胞活力、通透性、氧化及抗氧化能力和分泌功能等方面的影響。

近年來，血紅素氧化酶-1/一氧化碳（hemeoxygenase-1，HO-1/CO）系統在心血管疾病中的作用受到了廣泛的關注。HO-1與其作用產物CO、鐵、膽綠素、膽紅素涉及許多生理和病理過程。本文將在細胞水平上初步觀察HTG所致HUVEC氧化損傷對HO-1/CO系統的影響，進一步探討HTGBS致AS的機制。

1 實驗材料

HUVEC細胞株由南京醫科大學提供；DMEM購自Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；MTT購自Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HO-1（M-19）購自Santa Cruz公司。

2 實驗方法

2.1 HTGBS的收集與處理

從醫院收集人的正常血清及HTGBS，分別置于56℃水浴30 min滅活處理，并用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。血清中的甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）及血糖（GLU）指標均由醫院檢驗科全自動生化分析儀檢測。

2.2 HUVEC的傳代培養

將HUVEC細胞株培養于含10%新生牛血清的DMEM培養液中，置37℃、5%CO2的二氧化碳培養箱中。待細胞生長至近匯合狀態、鋪滿瓶壁80%以上時，進行傳代。

2.3 MTT法檢測HTGBS對HUVEC活力的影響

2.3.1 實驗分組

①陰性對照組：5%人正常血清；

②梯度濃度的HTGBS組：分別含HTGBS 1%、2%、3%、4%、5%（血清終濃度為5%，不足5%的部分用人正常血清補充）；

③空白對照組：5%人正常血清（不加細胞只加培養基）。

2.3.2 操作步驟 細胞以5×104/mL密度接種于96孔培養板，用含5%人正常血清的DMEM培養24 h后，換無血清DMEM（每組6孔）繼續培養。靜止培養24 h后按分組加入含不同濃度血清培養液繼續培養24～48 h；實驗結束后每孔加入 MTT溶液（5 g/L）20 μL，37℃繼續孵育 4 h，棄去培養液，每孔加150 μL DMSO，振蕩均勻后于酶標儀490 nm波長測吸光度（absorbance，A）值。

2.4 細胞中LDH活性、MDA含量和SOD活性的測定

分組同上，按說明書采用化學比色法測定細胞中LDH活性；硫代巴比妥酸反應物（TBARS）法測定MDA含量；黃嘌呤氧化酶法檢測細胞內SOD活性。

2.5 細胞中NO含量、總一氧化氮合酶（TNOS）和誘導型NOS（iNOS）活性的測定

分組同上，用硝酸還原法測定細胞血管內NO含量；用化學比色法測定內皮細胞中TNOS和iNOS活性。

2.6 ELISA測定碳氧血紅蛋白（Carboxyhemoglobin，COHb）的含量

溶液中的CO很容易與血紅蛋白結合生成 COHb，通過測定培養基中COHb含量可以間接反映CO的生成，COHb測定參照Morita等[2]方法：消化單層培養細胞，以5×104/mL密度接種于96孔培養板中，用含5%人正常血清的DMEM培養24 h后，換無血清DMEM靜止培養24 h，實驗分組同上（每組6孔），加入血清后繼續培養24 h。實驗結束前1 h每孔加入牛血紅蛋白50 μmol/L，選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔培養上清液的A值。

2.7 Western Blot檢測蛋白表達

細胞以5×104/mL密度接種于50 mL培養瓶，用含5%人正常血清的DMEM培養24 h后，換無血清DMEM靜止培養24 h，實驗分組同上，加入血清后繼續培養24 h。細胞收集在1.5 mL EP管，按說明書加入RIPA裂解液和PMSF，冰上裂解 30 min，4℃，12 000 rpm/min 離心 15 min，收集上清轉移到0.5 mL EP管，每組取100 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳。PVDF膜濕轉（Bio-Rad），350 mA轉100 min，室溫封閉 1 h，一抗 4℃冰箱孵育過夜（1∶500），洗膜后二抗室溫孵育2 h（1∶500），洗膜后二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。

2.8 統計學處理

運用SPSS 10.0軟件進行統計學處理分析，計量資料以±s表示，兩組數據間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。

3 實驗結果

3.1 人血清中 TC、TG、GLU的含量

與正常血清相比，單純HTGBS中僅TG明顯升高（P＜0.01），其余指標屬于正常范圍，見表1。

表1 混合血清中TC、TG、GLU的含量（±s）

表1 混合血清中TC、TG、GLU的含量（±s）

注：與正常血清組相比：*P＜0.01

分組（n=100）TC（mmol/L）TG（mmol/L）GLU（mmol/L）正常血清 4.51±0.03 1.25±0.02 5.2±0.13高甘油三酯血清 4.68±0.02 3.58±0.02* 5.0±0.10正常范圍 2.3～5.7 0.55～1.82 3.9～6.1

3.2 相差顯微鏡下HUVEC形態

正常血管內皮細胞生長狀態良好，貼壁較牢，細胞間連接緊密；細胞呈多角形或短梭形，邊界清楚，大小均勻，呈單層鋪路石樣鑲嵌排列；胞核圓形或橢圓形，位于細胞中央，多核仁；胞漿豐富（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡下HUVEC形態（×100）

3.3 MTT法檢測HTGBS對HUVEC活力的影響

經無血清抑制處理的HUVEC給予含5%正常血清（Control組）和含 1%、2%、3%、4%、5%HTGBS的細胞培養液繼續培養24、48 h后490 nm處測得吸光度值，結果如圖2所示：1%，2%，3%的HTGBS可小幅度促進HUVEC增殖，但4%、5%HTGBS明顯抑制HUVEC活力，與正常對照組相比有統計學意義 （P＜0.01）。由此確定HTGBS致HUVEC損傷的最佳實驗濃度5%，最佳作用時間為24 h。

圖2 不同濃度的HTGBS對HUVEC活力（MTT法測A值）的影響（±s,n=6）

3.4 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響

測定結果如表2所示：與正常對照組相比，HTGBS使得細胞培養液中LDH活性明顯升高（P＜0.01）；血管內皮細胞中SOD活性降低，膜脂質過氧化產物MDA含量明顯增加（P＜0.01）。

表2 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響（±s）

表2 HTGBS對HUVEC的LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響（±s）

注：與Control組相比：*P＜0.01

分組(n=6)LDH(U/g prot)MDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg prot)Control 0.128±0.014 0.261±0.033 20.083±1.909 HTGBS 0.277±0.030* 0.682±0.059* 15.959±2.084*

3.5 HTGBS對HUVEC中NO含量、TNOS和iNOS活性的影響

測定結果如表3所示：與正常對照組比較，HTGBS使HUVEC中NO含量、TNOS活性明顯降低（P＜0.01）；iNOS活性升高（P＜0.01）。

表3HTGBS對HUVEC中NO含量、TNOS和iNOS活性的影響（±s）

注：與Control組相比：*P＜0.01

3.6 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達及細胞培養液中COHb含量的影響

測定結果如表4，圖3所示：與正常對照組比較，HTGBS組HUVEC中HO-1蛋白表達代償性升高，細胞培養液中的COHb含量明顯增加（P＜0.01）。

表4 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達及細胞培養液中COHb 含量的影響（±s）

表4 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達及細胞培養液中COHb 含量的影響（±s）

注：與Control組相比：*P＜0.01

分組(n=6)HO-1蛋白表達(A值之比)COHb含量(A值)Control 0.640±0.042 0.136±0.016 HTGBS 0.828±0.063* 0.275±0.023*

圖3 HTGBS對HUVEC中HO-1蛋白表達的影響（±s,n=6)

4 討論

AS已經成為嚴重威脅人類健康的常見疾病。其發病機制復雜，諸多因素參與其中，而內皮細胞損傷作為始動環節之一已被公認[3]。內皮細胞形態和結構的完整性是維持內皮正常功能的前提，內皮細胞損傷的原因較多，高脂血癥作為引發動脈粥樣硬化及心腦缺血性疾病的重要因素之一，主要在于其對內皮細胞的損傷作用。高脂血癥可表現為高膽固醇血癥（HTC）、HTG或兩者兼有。現有的文獻關于HTC與AS的關系研究比較透徹，而HTG與AS的關系則一直頗有爭議。我國膳食以高糖低脂為特點，血脂紊亂以內源性甘油三酯升高最為多見，因此研究HTG在AS發病中的作用機制及其防治具有特別的重要意義。鄭關毅等[4]的研究表明，單純性HTG患者和高血壓伴HTG的病人存在脂質過氧化反應增強、抗氧化酶活性降低。目前已有實驗研究[5]證實，HTG患者及實驗性HTG動物體內均存有明顯的脂質過氧化損傷，包括血漿脂質過氧化物以及氧化修飾脂蛋白如氧化修飾低密度脂蛋白（LDL）、氧化修飾極低密度脂蛋白（VLDL）等含量增加。這些氧化修飾的脂蛋白均可以損傷血管內皮細胞，促進AS的形成。

MTT法是一種檢測細胞存活和生長增殖情況的方法，細胞活力（A值）能間接反映細胞的增殖和存活情況。LDH是糖酵解過程中一種重要的酶，廣泛存在于細胞漿中，當細胞膜損傷、通透性增加時，胞漿中的LDH才大量釋放到細胞外，因此細胞培養液中LDH活性的高低是反應細胞受損傷程度的一個非常靈敏的指標。本實驗結果表明1%、2%、3%的HTGBS雖可小幅度促進HUVEC增殖，但沒有統計學意義，但4%、5%HTGBS明顯抑制血管內皮細胞活力，與正常對照組相比有統計學意義（P＜0.01），因此以本實驗為基礎，確定以含5%HTGBS為最佳實驗濃度；HTGBS組細胞培養液中LDH活性明顯高于正常對照組（P＜0.01），本實驗結果表明HTGBS可使血管內皮細胞活力降低并致細胞損傷使其通透性增加。

MDA是細胞膜脂質過氧化的最終分解產物，其含量的多少可反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是機體內抗氧化酶系統的重要組成部分，主要清除O-2，抑制脂質過氧化反應。SOD活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，對兩者結果分析具有一定生物學意義。本實驗研究結果表明，HTGBS組細胞中SOD活性明顯低于正常對照組（P＜0.01），MDA含量明顯高于正常對照組（P＜0.01），提示HTGBS可顯著增加脂質過氧化物含量并降低細胞的抗氧化能力。

正常生理情況下NO是由血管內皮細胞合成分泌的一種重要的信使分子和效應分子，執行重要的生物功能，包括擴張血管、抗血小板聚集、抑制平滑肌細胞增殖等，其生物合成主要受NOS的調節。生物組織中已經確定的NOS亞型有3種：神經元型NOS（nNOS）、內皮型NOS（eNOS）、iNOS，前兩者又合稱為結構型 NOS（cNOS），三者總稱TNOS。

在AS病變發展過程中，內皮功能受損，內皮源性cNOS表達或活性下降，內皮源性NO產生減少，而iNOS活性增加，產生大量NO自由基，刺激細胞凋亡和膠原組織降解，促進AS的形成，NO自由基還可與O-2反應形成過氧化亞硝酸鹽，引起組織損傷。NOS在AS的發病機制方面有著雙重作用：在正常情況下，eNOS催化產生低濃度的NO，這對機體抗AS是有益的[6-8]；然而在高脂血癥、AS時，它通過依賴于四氫生物嘌呤（BH4）途徑而形成超氧化物[9-10]。如果再加上局部iNOS的活化，將會導致粥樣硬化斑塊內高濃度的有細胞毒作用的過氧化亞硝酸鹽形成。最近 Bohr-Roussel、B?ger RH等[11-12]給高膽固醇喂養的兔長期應用iNOS特異的抑制劑2周后，發現AS斑塊、主動脈內膜/中膜比例與正常對照組相比無差異，這表明iNOS抑制劑確能限制高膽固醇兔的AS進程。本實驗研究結果表明，HTGBS組HUVEC中內皮依賴性舒張因子NO含量、TNOS活性與正常對照組相比明顯降低（P＜ 0.01）；i-NOS活性與正常對照組相比明顯升高（P＜0.01）。初步提示HTGBS可以通過降低TNOS的活性，增加iNOS活性，直接或間接地減少內源性NO的合成與釋放。

HO是血紅素降解起始酶和最為重要的限速酶。它降解血紅素產生CO、膽綠素和鐵離子。HO在人體內廣泛存在，參與多種生理和病理過程，與心血管疾病有著密切的聯系。HO-1源性的CO在氧化應激狀態下，可通過調節心腦血管系統的緊張度，發揮心腦血管保護作用[13]。本實驗在細胞水平上初步觀察HTGBS所致HUVEC氧化損傷對HO-1/CO系統的影響，Western Blot結果顯示，與正常對照組比較，HTGBS組HUVEC中HO-1蛋白表達代償性升高，細胞培養液中的CO含量明顯增加，實驗結果初步提示，HTGBS損傷的HUVEC中HO-1表達上調是細胞代償性保護性反應。

綜上所述，HTGBS不僅能降低細胞的抗氧化能力，增加脂質過氧化物的生成損傷血管內皮細胞，代償性上調細胞HO-1蛋白表達，并且可以通過影響NO/NOS系統從而導致血管內皮功能障礙。

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