RRLC(高分離度快速液相色譜)法測定孕鈣片中葉酸的含量

劉 杰 季曉娟 葛 亮 田樹革＊

1．新疆醫科大學附屬中醫醫院藥學部，新疆 烏魯木齊 830002;2．新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部，新疆 烏魯木齊 830011;3．新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊 830011

葉酸又稱蝶酰谷氨酸 (PGA)［1]，是人和動物為維持正常的生理功能而必需從食物中獲得供給的微量有機物質。葉酸缺乏可致孕婦妊高征、先兆子癇、胎盤早剝的發生率增高;胎盤發育不良導致自發性流產;其中影響最大的是引起胎兒神經管畸形 (NTD)［2]。近年來，我國已在嬰幼兒、老年食品中強化葉酸、乳粉中添加葉酸。因此，建立簡單、快速、準確的測定各種食物尤其是嬰幼兒、孕婦強化食品中的葉酸含量的方法有重要現實意義［3]。目前常用的檢測葉酸方法有：比色法、薄層層析法、微生物法、酶聯免疫法和高效液相色譜法［4－7]。孕鈣片是以碳酸鈣、葡萄糖酸鋅、葉酸、維生素類成分等為主要原料制成的保健食品，具有補充鈣、鋅及葉酸的保健功能，我們采用RRLC(高分離度快速液相色譜)儀對孕鈣片中的葉酸含量進行測定，確定測定葉酸含量及控制的有效方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RRLC(高分離度快速液相色譜)儀［包括G1322A脫氣裝置，G1312B二元高壓泵，G1367C高性能自動進樣器，G1316B柱溫箱，G1315C二極管陣列式檢測器，色譜柱Zorbax XDB－C18(4.6×50mm，1.8um)];XP205DR電子分析天平 (梅特勒－托利多儀器上海有限公司);KQ－400DB型數控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);TGL－16B離心機 (上海安亭科學儀器廠)。

1.2 樣品與試劑

葉酸對照品 (購自中國藥品生物制品檢定所);乙腈為色譜純;水為超純水。其它試劑均為分析純，孕鈣片購自新疆特豐藥業股份有限公司，批號為 20091218，20091219，20091220。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Zorbax XDB－C18(4.6×50mm，1.8um)，流動相：乙腈－5%甲酸 (31：69)，檢測波長：280nm，流速：1.0mL·min－1，柱溫：30℃。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取葉酸對照品適量于50ml容量瓶中，加0.5%氨水溶液溶解，放入超聲儀中超聲20min，定容，搖勻，制成2ug·mL－1葉酸對照品溶液。

2.3 樣品溶液制備

取本品10片，研細，混勻，取約1.0g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入25mL 0.5%氨水溶液，加塞搖勻，放入超聲儀中超聲20min，使葉酸得到充分提取，取出。加入5mL氯仿，劇烈振搖片刻，靜止待分層，取上清液少許于10000r/min離心10min，即得。采用RRLC(高分離度快速液相色譜)儀檢測孕鈣片中葉酸的含量，其色譜圖見圖1。1－為葉酸標準品。

圖1 葉酸含量色譜圖

2.4 線性試驗

分別精密量取葉酸對照品溶液1、2、3、4、5 ml置10ml量瓶中，加0.5%氨水定容，進樣測定，以峰面積(A)對其濃度 (c)進行線性回歸，得線性方程為A=128.12c+23.46，r=0.9996。表明葉酸濃度在0.2－1.0μg·ml－1范圍內，有良好的線性關系。

2.5 精密度實驗

精密吸取葉酸對照品溶液5uL，連續進樣6次，測定葉酸峰面積，其RSD為1.12%。

2.6 穩定性實驗

精密吸取孕鈣片樣品溶液5uL，分別在0，2，4，8，12，24h進樣，測定葉酸峰面積，其RSD值為1.56%，表明樣品溶液在24h內穩定。

2.7 重復性實驗

精密稱取孕鈣片粗粉1.0g，共6份，按樣品測定法測定，測得葉酸含量平均值為 0.88mg· g－1，RSD為1.32%。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的孕鈣片粗粉0.5g，共6份，分別精密加入葉酸對照品0.46mg，以下按樣品溶液制備，照上述色譜條件進樣測定，其平均回收率為99.28%，RSD為2.65%。結果見表1。

表1 葉酸加樣回收率結果

2.9 樣品的測定

按“2.3”方法制備樣品液，精密吸取葉酸對照品溶液5uL，樣品溶液5uL，分別注入高效液相色譜儀，測定色譜峰峰面積，計算其含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 結論

我們采用RRLC(高分離度快速液相色譜)儀測定孕鈣片中葉酸的含量，檢測結果準確，方法簡便。高分離度快速液相色譜儀具有分離速度快、檢測靈敏度高等優點，是一種先進的分離檢測技術。本實驗的相關研究將有助于葉酸類保健品相關產品的分析檢測。

［1]汪錦邦，顧鵬，章德宏，等．葉酸分析方法的研究進展［J]．中國食品添加劑，2000，3(6)：49－53．

［2]聶小鳳，許榕仙，李健，等．葉酸在婦產科疾病中的研究現狀［J]．海峽預防醫學雜志，2009，15(1)：27－29．

［3]呂運開，邊超，王燕桓，等．固相萃取－離子對液相色譜法測定保健品中的葉酸［J]．食品科學，2009，30(14)：171－174．

［4]劉莉治，羅曉燕，周洪偉，等．高效液相柱后衍生法測定嬰幼兒食品中的葉酸［J]．中國衛生檢驗雜志，2007，17(4)：1179－1180．

［5]劉波，王曉工，王心祥，等．高效液相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸［J]．中國乳品工業，2003，31：39－40．

［6]Dansky LV，Andermann E，Rosenblatt D，et al．Anticonvulsants，folate levels and pregnancy outcome：A prospective study［J]．Ann Neurol，1987，21：76 －82．

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