硫酸慶大霉素片含量測定的不確定度評估

邢以文

本品為氨基糖苷類廣譜抗生素，對多種革蘭陰性菌及陽性菌都具有抑菌和殺菌作用。對綠膿桿菌、產氣桿菌、肺炎桿菌、沙門氏菌屬、大腸桿菌及變形桿菌等革蘭陰性菌和金葡菌等作用較強，臨床上用于金葡菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、克雷白桿菌、變形桿菌和其他敏感菌所引起的敗血癥、呼吸道感染、膽道感染、化膿性腹膜炎、顱內感染、尿路感染及菌痢等疾患。本品按照《中國藥典》2005年版二部二劑量法［1］檢驗，所得結果進行不確定度分析。

測量不確定度是衡量分析測試結果的質量的尺度。不確定度越小，分析測試結果越可靠，因此，測量不確定度是測量結果質量的定量表征。根據ISO/IEC17025［2］和CNAS-CL 07:2011《測量不確定度的要求》［3］的要求，檢測實驗室應該建立并實施測量不確定度評估程序。

1 儀器、試藥及菌種

儀器:智能抑菌圈測定儀(CAM-ⅢB型，上海波浦電腦系統工程有限公司);電恒溫水浴鍋(H.S型，上海醫療器械廠);隔水式電熱恒溫培養箱(PYX-DHS一40X5型，國營創新醫療器械廠);高壓濕熱蒸汽滅菌器(LMQ.C型，山東新華醫療器械有限公司);測定抗生素效價用培養皿(直徑90 mm)，牛津杯，陶瓦蓋等;電子天平(AE240型，Mettler Toledo(中國)有限公司);數字顯示移液器(200～1000 μl Finnpipette，芬蘭移液器有限公司)。

試藥及菌種:磷酸二氫鉀(分析純)，磷酸氫二鉀(分析純)，自配pH7.8磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS pH7.8);硫酸慶大霉素片(規格40000 U，批號為20060405，開封制藥＜集團＞有限公司);抗生素檢定培養基I(pH值為7.8～8.0，北京三藥科技開發公司);短小芽孢桿菌［CMCC(B)63202，中國藥品生物制品檢定所］。

2 方法與結果

2.1 緩沖液、菌懸液及雙碟制備 取磷酸氫二鉀11.18 g與磷酸二氫鉀0.82 g，加水使成2000 ml，濾過，在115℃滅菌30 min，即得磷酸鹽緩沖液(pH=7.8)。取短小芽孢桿菌［CMCC(B)63202］的營養瓊脂斜面培養物，接種于盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在35℃ ～37℃培養7 d，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應有芽孢85% 以上，用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30 min，即得短小芽孢桿菌菌懸液。

取直徑約90 mm，高16～17 mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的抗生素檢定培養基120 ml，使在碟底內均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層;另取抗生素檢定培養基I適量加熱融化后，放冷至60℃，加入短小芽孢桿菌菌懸液適量(能得清晰的抑菌圈為度，使標準品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑為18～22 mm)搖勻，在每一雙碟中分別加入5 ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置水平臺上冷卻后，在每一雙碟中以等距離均勻放置牛津杯4個，用陶瓦圓蓋覆蓋，備用。

2.2 標準品溶液的制備 精密稱取慶大霉素標準品25.19 mg(638U/mg×20.15 mg=12856U)置25 ml量瓶中，加滅菌水溶解，并稀釋置刻度，搖勻(514.240U/ml)。

2.3 供試品溶液的制備 取供試品5片，加少量滅菌水研細，移置200 ml量瓶中，加滅菌水至刻度，搖勻(1000 U/ml)。

2.4 測定方法 照抗生素微生物檢定法，使用移液槍分別吸取濃度為10.285、5.142U/ml的標準品溶液和濃度為10U/ml、5U/ml的供試品溶液各275 μl至上述準備好的雙碟中的牛津杯內，蓋好陶瓦蓋，在36℃下培養14～16 h后，使用智能抑菌圈測定儀測量各抑菌圈的直徑，并計算含量。

2.5 不確定度評估

2.5.1 建立數學模型

見含量測定公式。

T1:供試品低劑量所致抑菌圈直徑或面積

T2:供試品高劑量所致抑菌圈直徑或面積

S1:標準品低劑量所致抑菌圈直徑或面積

S2:標準品高劑量所致抑菌圈直徑或面積

P:估計效價

從檢測過程和數學模型分析，不確定度主要來源于標準品、供試品的稱量和溶液的配制過程、加液至牛津杯過程中移液槍以及測量用抑菌圈測定儀的誤差、最后結果FL值。

圖1 不確定度分量分析圖

2.5.2 標準品溶液的標準不確定度

2.5.2.1 天平稱量引入的不確定度 ①天平線性:實驗使用AE240電子天平，依據說明書，線性為±0.2 mg，按矩形分布，故U(m1)= 0.2/=0.12 mg;②天平重復性:AE240電子天平說明書標明重復性為0.05 mg(天平參數)，由于采用減量法稱量，故:

2.5.2.2 容量玻璃儀器引入的不確定度 ①25 ml量瓶;a校正:允差:±0.03 ml，中間分布，U(V1)= 0.03/=0.012 ml，b 重復性:由實驗求得標準偏差;c溫度:ΔV=(2.1 ×10-4-1.5×10-5)×25×(25-20)=0.024 ml

按正態分布U(V3)=0.0122/2=0.012 ml

Urel(V1)=0.072/25=0.0029

②50 ml量瓶:a校正:允差:±0.05 ml，中間分布，U(V1)=0.05/=0.020 ml

b重復性:由實驗求得標準偏差U(V2)=0.08 ml

c溫度:

ΔV=(2.1 ×10-4-1.5 ×10-5)×50 ×(25-20)=0.048 ml

按正態分布U(V3)=0.048/2=0.024 ml

Urel(V2)=0.086/50=0.0017

③100 ml量瓶:a校正:允差:±0.10 ml，中間分布，U(V1)= 0.10/=0.041 ml

b重復性:由實驗求得標準偏差U(V2)=0.08 ml

c溫度:

ΔV=(2.1 ×10-4-1.5 ×10-5)×100 × (25-20)=0.098 ml

按正態分布U(V3)=0.098/2=0.049 ml

④5 ml移液管

a校正:允差:±0.015 ml，中間分布，U(V1)= 0.015/=0.0061 ml

b重復性:由實驗求得標準偏差U(V2)=0.02 ml

c溫度:ΔV=(2.1×10-4-1.5×10-5)×5×(25-20)=0.0049 ml

按正態分布U(V3)=0.0049/2=0.0024 ml

Urel(V4)=0.021/5=0.0042

2.5.2.3 標準品溶液的不確定度 由于使用25 ml量瓶2個，5 ml移液管 2 支，故

2.5.3 供試品溶液的不確定度

2.5.3.1 容量玻璃儀器引入的不確定度

①200 ml量瓶:a校正:允差:±0.15 ml，中間分布，U(V1) = 0.15/=0.061 ml

b重復性:由實驗求得標準偏差U(V2)=0.1 ml

c溫度:

ΔV=(2.1×10-4-1.5×10-5)×200×(25-20)=0.196 ml

按正態分布U(V3)=0.196/2=0.098 ml

Urel(V3)=0.15/200=0.00075

②100 ml量瓶引入的不確定度

Urel(V6)=0.0010

③50 ml量瓶

Urel(V8)=0.0017

④5 ml移液管

Urel(V10)=0.0042

2.5.3.2 供試品溶液的不確定度 由于使用50 ml量瓶二個，5 ml移液管二支，故

2.5.4 滴加溶液 275 μl數字顯示移液器

①校正:允差:± 2 μl，中間分布，U(V1)=2 μl=0.82 μl

②重復性:由實驗求得標準偏差U(V2)=0.51 μl

2.5.5 抑菌圈測定

2.5.5.1 智能抑菌圈測定儀

①均勻性:由實驗求得相對標準偏差Urel(V1)=0.00037

②重復性:由實驗求得相對標準偏差Urel(V2)=0.00052

2.5.5.2 實驗結果 測定效價PT=98.6%平均可信限率PT的FL=2.2%

由平均可信限率(PT的FL)，按正態分布 k=2

2.5.6 合成相對標準不確定度的計算

2.5.7 合成標準不確定度的計算

2.5.8 擴展不確定度計算 測量結果符合正態分布，包含

因子k=2，置信概率為9 5.4 5%

U=K×u c(X)=2 ×1.6=3.2

2.6 硫酸慶大霉素片含量的表示 本品含硫酸慶大霉素為標示量的(9 8.6±3.2)%;k=2

3 結論

分析評估不確定度時，首先要盡量考慮產生不確定度的所有來源，因為合成不確定度是由各方面產生的不確定度分量合成而來的。

本方法測量結果的不確定度主要來源于實驗結果的平均可信限率(PT的FL值)，這也從客觀上反映出抗生素微生物檢定法的不足之處，就是微生物實驗的重復性相對較差，這是由于細菌生長的不確定因素較多造成的。可見，測量不確定度對于反映測量過程的準確性具有重大意義。本方法能夠較為準確的反映出硫酸慶大霉素片含量測定(微生物檢定法)的不確定度。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部).北京:化學工業出版社，2005:731，附錄8l-84.

［2］中國實驗室國家認可委員會.ISO/IEC 17025:2005檢測和校準實驗室認可準則.中國實驗室國家認可委員會，2005.

［3］中國實驗室國家認可委員會.CNAS-CL 07:2011測量不確定度的要求.中國實驗室國家認可委員會，2011.