HPLC-ELSD法測定蘇氨酸中脯氨酸的含量

周浩 黃鑫 吳秀蘭 蔣波 吳俗

蘇氨酸是一種重要的營養強化劑，有恢復人體疲勞，促進生長發育，保護細胞膜，促進磷脂合成和脂肪酸氧化，抗脂肪肝藥用效能，是復合氨基酸輸液中的一種，同時又是制造高效低過敏的抗生素單酰胺菌素的原料，蘇氨酸中常見雜質為脯氨酸，中國藥典2010版中使用TLC法[1]，對雜質脯氨酸進行限量，但無法定量，本文建立蘇氨酸中脯氨酸的定量方法，經驗證，專屬性好，靈敏度高，重復性好，準確度高。

1 儀器與試藥

WATERS e2695泵;Alltech蒸發光散射檢測器2000ES;蘇氨酸(正大天晴，批號:1001011、1001012、1001021);脯氨酸對照品(AR，進口分裝，批號100328，惠興生化試劑)。

2 方法與結果

2.1 專用溶劑 25%乙腈水溶液

2.2 供試品溶液 取蘇氨酸50 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加專用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 對照品溶液 取脯氨酸對照品適量，精密稱定，加專用溶劑溶解并稀釋并制成每1 ml分別含10、20、30、40和50 μg的溶液，即得。

2.4 色譜條件 色譜柱Sepax HP-Silica(250 mm×4.6 mm，5 μm)，40℃;流動相水-異丙醇-正己烷-冰醋酸-三乙胺(200∶750∶50∶6∶0.6)，1.0 ml/min，蒸發光檢測器(載氣 2 L/min，漂移管 95℃)。

2.5 專屬性 配制含蘇氨酸5 mg/ml和脯氨酸20 μg/ml的混合溶液，進樣，結果脯氨酸和蘇氨酸有效分離，專用溶劑無干擾(見圖1)。

圖1 混合溶液色譜圖(下)和專用溶劑色譜圖(上)

2.6 線性關系 精密量取各對照品溶液20 μl，分別檢測，結果脯氨酸濃度在10～50 μg/ml范圍內的濃度對數值(X)與峰響應值對數值(Y)呈顯著線性關系，線性方程 Y=1.5224X+7.2756，r=0.9981。

2.7 系統精密度 精密量取對照品溶液(20 μg/ml)20 μl，連續測定6次，結果RSD=1.8%，表明系統精密度良好。

2.8 定量限及檢測限 取對照品溶液(10 μg/ml)，逐級稀釋，分別測定，當信噪比約10∶1和3∶1時，分別計算定量限和檢測限，結果脯氨酸的定量限為5 μg/ml，檢測限為2 μg/ml。

2.9 方法重復性 取樣品(批號:201001021)，制備5份供試品溶液，分別測定，結果RSD=1.2%，表明重復性良好。

2.10 回收率 取樣品(1001011批)約25 mg，精密稱定，加入對照品溶液(50 μg/ml)2.0 ml，置10 ml量瓶中，溶解并稀釋至刻度，共制備6份，分別測定，結果平均回收率99.2%，RSD=2.2%，表明回收率良好。

2.11 樣品測定 取蘇氨酸(批號為1001011、1021012和1001021)，分別測定，結果3批中脯氨酸含量分別為0.40%、0.20%和0.00%。

3 討論

3.1 氨基酸類一般無明顯紫外吸收，檢測難度大，目前常見的測定方法有三種[2、3、4]，陽離子交換后柱后衍生、反相色譜分離柱前衍生和氨基酸直接分析儀，成本高，操作繁瑣，衍生物不穩定。本法無需衍生，同時解決了無紫外吸收缺點，有一定的應用價值，并且采用了正相柱反相系統，有一定的新穎性。

3.2 根據兩成分的分離情況，也可以考慮用此色譜條件開發脯氨酸中蘇氨酸的定量方法。

3.3 蘇氨酸也是常見藥用輔料，可以用此進一步開發制劑中輔料蘇氨酸的含量測定方法。

[1]國家藥典委員會.ChP(中國藥典).2010版.VolⅡ(二部).中國醫藥科技出版社，2010:323.

[2]丁永勝，牟世芬.氨基酸的分析方法及其應用進展.色譜，2004，(03).

[3]趙晶晶，李宏梁.茚三酮柱后衍生法測定軟香酥糕點中氨基酸含量及其營養評價食品科學，2011(09).

[4]尚素芬.PITC柱前衍生反相色譜法和OPA柱后衍生離子交換色譜法測定氨基酸含量的比較.河北大學學報(自然科學版)，1996(02).