編碼酶復(fù)合體I亞單位的線粒體基因新突變導(dǎo)致的MELAS綜合征

趙丹華， 王朝霞， 李務(wù)榮， 洪道俊， 鄭日亮， 孫永安， 張 巍， 袁 云

酶復(fù)合體I(NADH:泛醌氧化還原酶)是線粒體呼吸鏈的第一個(gè)酶復(fù)合物，其功能是催化一對(duì)電子從NADH傳遞給泛醌，在整個(gè)呼吸鏈的電子傳遞及能量代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。酶復(fù)合體I也是呼吸鏈中最大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的一個(gè)蛋白復(fù)合物，主要由40余個(gè)亞單位組成，其中包括7個(gè)由線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)編碼的NADH 脫氫酶(NADH dehydrogenase，ND)亞單位，即 ND1-ND6 和ND4L，以及至少 38 個(gè)由核基因編碼的亞單位［1，2］。編碼ND亞單位的mtDNA(即ND基因)突變多出現(xiàn)在Leigh綜合征(Leigh syndrome，LS)以及 Leber視神經(jīng)病患者中。但是，線粒體病的基因型和臨床表型之間常表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。近年來(lái)，國(guó)外相繼報(bào)道了多例ND基因突變導(dǎo)致的線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和中風(fēng)樣發(fā)作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic academia and stroke-like episodes，MELAS)患者［3～7］。我們?cè)趫?bào)道了 ND5亞單位編碼區(qū)最常見的突變-G13513A突變后［8］，最近又發(fā)現(xiàn)了4例由ND基因的新/罕見突變導(dǎo)致的MELAS綜合征患者，在此報(bào)道其臨床、骨骼肌病理改變特點(diǎn)和基因分析結(jié)果。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 4例患者的臨床表現(xiàn)均高度提示線粒體腦肌病或腦病。經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)這4例患者的肌肉、外周血和(或)尿液組織的mtDNA的常見突變位點(diǎn)(包括 A3243G、T3271C、A8344G、T8993C/G、G13513A)均為陰性。

患者1，女，19歲。自11歲后開始反復(fù)發(fā)作伴視覺先兆的偏頭痛，16歲時(shí)出現(xiàn)肌陣攣癲癇，間斷有四肢強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，19歲時(shí)因突發(fā)雙眼視物模糊伴雙側(cè)聽力輕度下降入院。家族史陰性。體格檢查:神志清楚，言語(yǔ)流利，雙眼皮質(zhì)盲，雙耳聽力略減退，伸舌右偏，四肢肌力5級(jí)，右側(cè)Babinski征陽(yáng)性。靜態(tài)血乳酸4mmol/L(正常值0.5～2mmol/L)。發(fā)病以來(lái)多次行頭部MRI檢查示雙側(cè)頂、枕葉皮質(zhì)不對(duì)稱異常信號(hào)及雙側(cè)基底節(jié)、腦干對(duì)稱異常信號(hào)(圖1A，B)。腰穿腦脊液檢查及腦血管造影檢查均未見異常。

患者2，男，31歲。在21歲時(shí)于車禍后出現(xiàn)一過性意識(shí)障礙，1個(gè)月后，患者突發(fā)左顳部頭痛伴偏盲、失語(yǔ)及失讀，頭CT示左側(cè)枕葉低密度灶。此后患者出現(xiàn)反復(fù)的卒中樣發(fā)作，伴隨難治性癲癇、反應(yīng)遲鈍以及人格改變。家族中無(wú)類似患者。體格檢查:神志清楚，感覺性失語(yǔ)，右側(cè)中樞性舌癱，四肢肌力5級(jí)，肌張力稍高，雙側(cè)Babinski征陽(yáng)性。靜態(tài)血乳酸4.2mmol/L。頭部MRI顯示雙側(cè)頂、枕、顳葉多發(fā)病灶，頭部MRA未見異常。

患者3，女，13歲。足月順產(chǎn)，自幼運(yùn)動(dòng)發(fā)育正常。6歲時(shí)出現(xiàn)雙眼視力下降，當(dāng)時(shí)診斷為球后視神經(jīng)炎，予激素治療1個(gè)月后視力基本恢復(fù)。10歲后逐漸出現(xiàn)雙眼斜視。11歲時(shí)于發(fā)熱后出現(xiàn)易驚嚇及行為異常。當(dāng)時(shí)頭MRI示雙側(cè)基底節(jié)及中腦背側(cè)對(duì)稱性異常信號(hào)，左側(cè)顱中窩蛛網(wǎng)膜囊腫(圖1C，D)。12歲出現(xiàn)行走時(shí)左上肢向后背伸，雙腿屈曲。入院前3個(gè)月突發(fā)偏頭痛、癲癇發(fā)作、視力下降及右側(cè)同向性偏盲。家族史陰性。入院查體:身材瘦小，軀干及四肢毛發(fā)明顯增多，背部毛發(fā)呈旋渦狀改變。左足內(nèi)翻畸形，雙足跟腱攣縮。神志清楚，輕度構(gòu)音障礙，眼底視乳頭邊清，色略蒼白。雙眼球外斜位，雙眼內(nèi)收略差，雙側(cè)瞳孔等大等圓，對(duì)光反射遲鈍，輻輳反射消失。右側(cè)中樞性面癱。四肢一般性力弱，左上肢肌張力稍高，右上肢肌張力稍低。雙手輪替動(dòng)作笨拙。雙側(cè)Babinski征陽(yáng)性。靜態(tài)血乳酸2.9mmol/L。入院后頭MRI示雙側(cè)基底節(jié)、中腦及左枕葉異常信號(hào)(圖1E，F(xiàn))。

患者4，女，28歲。自幼智力及運(yùn)動(dòng)發(fā)育輕度落后。8歲時(shí)出現(xiàn)血尿、蛋白尿，24歲時(shí)發(fā)現(xiàn)左腎萎縮。此后逐漸出現(xiàn)耳聾、癲癇、反復(fù)的卒中樣發(fā)作及認(rèn)知功能減退。母親及外婆均有糖尿病。體格檢查:身材瘦小，多毛，脊柱側(cè)彎。神志清楚，中度構(gòu)音障礙。雙眼皮質(zhì)盲，可見粗大水平眼震，雙側(cè)軟腭上抬力弱，咽腭反射消失。四肢近端力弱，四肢肌張力低，右側(cè)Babinski征陽(yáng)性。靜態(tài)血乳酸3.9mmol/L。頭MRI示右側(cè)基底節(jié)、雙側(cè)頂、枕葉及中腦多發(fā)長(zhǎng)T1長(zhǎng)T2信號(hào)(圖1G，H)，雙側(cè)基底節(jié)鈣化。

1.2 研究方法

1.2.1 骨骼肌病理檢查 在患者或其家屬簽署知情同意書后，對(duì)患者進(jìn)行左肱二頭肌活檢。冰凍切片分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)、改良Gomori三色(MGT)、油紅 O(ORO)、高碘酸 Schiff反應(yīng)(PAS)、三磷酸腺苷酶(ATP酶)、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH-TR)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、細(xì)胞色素C氧化酶(COX)及非特異性酯酶(NSE)染色。

1.2.2 mtDNA突變分析 (1)常規(guī)酚氯仿法提取肌肉組織DNA，蛋白酶K-鹽析法提取外周血DNA，玻璃奶法提取尿沉渣DNA。(2)肌肉mtDNA全長(zhǎng)測(cè)序:具體方法見文獻(xiàn)［9］。(3)PCR-RFLP法檢測(cè)點(diǎn)突變的突變負(fù)荷:對(duì)發(fā)現(xiàn)的3種點(diǎn)突變用PCR-RFLP法進(jìn)一步驗(yàn)證，并進(jìn)行突變負(fù)荷定量分析。PCR反應(yīng)條件均為:變性94℃ 30s，退火57℃30s，延伸72℃ 30s，共32個(gè)循環(huán)。所用引物序列及限制性內(nèi)切酶種類詳見表1。用Genetools圖像分析軟件掃描酶切產(chǎn)物的電泳條帶吸光度值，計(jì)算突變負(fù)荷。(4)PCR-RFLP法對(duì)發(fā)現(xiàn)的mtDNA新點(diǎn)突變?cè)诓糠只颊叩哪赶涤H屬及100例正常人中進(jìn)行篩查。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷 根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)和神經(jīng)影像學(xué)特點(diǎn)，病例1、3和4的臨床診斷為青少年起病的MELAS/LS疊加綜合征，病例2診斷為成人起病的MELAS綜合征。

2.2 肌肉病理檢查 患者1肌肉活檢未見異常。患者2和3可見SDH深染的血管(strongly succinate dehydrogenase-reactive vessels，SSVs)，未見破碎紅纖維(ragged-red fibers，RRFs)及COX陰性肌纖維。患者4肌肉病理檢查可見RRFs和SSVs。

2.3 mtDNA突變檢測(cè) 4例患者的肌肉mtDNA全長(zhǎng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，病例 1存在 ND3編碼區(qū)的T10191C突變，導(dǎo)致第45位的絲氨酸變?yōu)楦彼?p.S45P)，該突變?yōu)橐褕?bào)道的致病性突變;病例2存在ND4編碼區(qū)的A11470C突變，導(dǎo)致第237位的賴氨酸變?yōu)樘於０?p.K237N);病例3為ND5編碼區(qū)的T13046C突變，導(dǎo)致第237位的甲硫氨酸變?yōu)樘K氨酸(p.M237T);病例4存在長(zhǎng)約1.4kb的mtDNA單一大片段缺失，Del 13025-13033:14417-14425，缺失范圍包括部分ND5及ND6編碼區(qū)。后3種突變均為尚未報(bào)道的新突變。為進(jìn)一步證實(shí)新發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變的致病性，我們用PCR-RFLP方法驗(yàn)證該突變的突變負(fù)荷在肌肉、血液和尿液中存在明顯差別。此外，例3母親的血液及尿液DNA中并未檢測(cè)到T13046C突變(圖2)。對(duì)100例正常對(duì)照進(jìn)行篩查，均未見A11470C和T13046C突變。例4的測(cè)序結(jié)果見圖3。

表1 PCR-RFLP法檢測(cè)例1-3的mtDNA點(diǎn)突變時(shí)所用引物序列及限制性內(nèi)切酶

3 討論

本組4例患者的主要臨床特點(diǎn)為青少年發(fā)病的卒中樣發(fā)作、癲癇、偏頭痛、聽力下降、身材矮小和血乳酸水平升高，頭部MRI顯示病灶主要累及顳頂枕葉皮質(zhì)，符合MELAS綜合征的表現(xiàn)。其中3例(例1、3、4)還有眼球活動(dòng)障礙、眼球震顫、真性球麻痹、共濟(jì)失調(diào)以及肌張力障礙等腦干/基底節(jié)受累的表現(xiàn)，頭部MRI也顯示除皮質(zhì)病灶外，雙側(cè)基底節(jié)和腦干亦有病變，提示MELAS疊加 Leigh綜合征。mtDNA全長(zhǎng)測(cè)序證實(shí)這4例患者均攜帶mtDNA突變，突變位于ND亞單位編碼區(qū)，證實(shí)ND基因突變是部分MELAS或MELAS/Leigh疊加綜合征患者的分子病理學(xué)基礎(chǔ)。

我們發(fā)現(xiàn)這4例患者的突變分布在不同的ND亞單位編碼區(qū)，包括 ND3(T10191C突變)、ND4(A11470C突變)、ND5(T13046C突變)和影響ND5-ND6的大片段缺失。除T10191C為文獻(xiàn)已報(bào)道的罕見致病性突變［5，10～14］以外，其余 3 種突變均為目前尚未報(bào)道的新突變。對(duì)于A11470C和T13046C兩種新的點(diǎn)突變，因?yàn)樗鼈兌季哂幸韵绿攸c(diǎn):(1)PCR-RFLP證實(shí)該突變?yōu)楫愘|(zhì)性突變;(2)在不同的組織中突變比例不同，肌肉及尿液的突變比例遠(yuǎn)高于血液;(3)突變引起的氨基酸改變位點(diǎn)在種系進(jìn)化過程中高度保守;(4)mtDNA全長(zhǎng)測(cè)序除外了其它致病性突變的可能;(5)100例正常對(duì)照中沒有檢測(cè)到相同突變，綜上支持它們均為致病性突變。

在本組患者中，與其他3例患者的突變形式不同，例4為單一的mtDNA大片段缺失。mtDNA單一大片段缺失通常導(dǎo)致慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹、Kearn-Sayre綜合征和Pearson綜合征，而罕有導(dǎo)致MELAS綜合征的報(bào)道。本組例4則表現(xiàn)為典型的MELAS綜合征伴嚴(yán)重的腎臟受累，而沒有眼外肌麻痹的表現(xiàn)。到目前為止，文獻(xiàn)中僅有1例mtDNA大片段缺失所致的MELAS患者，該患者也同時(shí)合并Fanconi綜合征［15］。我們的發(fā)現(xiàn)一方面擴(kuò)大了MELAS綜合征的突變譜系，另一方面也提示對(duì)MELAS綜合征合并腎臟受累的患者，當(dāng)常規(guī)mtDNA點(diǎn)突變篩查沒有發(fā)現(xiàn)致病突變時(shí)，須考慮有無(wú)mtDNA片段缺失的可能性。

值得注意的是，本文中4例線粒體腦肌病患者均沒有明確的母系遺傳家族史，而且基因檢測(cè)也進(jìn)一步證實(shí)例3攜帶的突變?yōu)樾律蛔儭４它c(diǎn)與常見的mtDNA A3243G(位于tRNA編碼區(qū))突變有很大的不同，后者導(dǎo)致的MELAS患者常表現(xiàn)出母系遺傳的特點(diǎn)。而ND基因突變與A3243G突變的另外一個(gè)顯著不同之處，在于前者導(dǎo)致的MELAS患者常缺乏RRFs，但SSVs的出現(xiàn)頻率則相對(duì)較高［6］，本組患者也證實(shí)這一特點(diǎn)。因此，對(duì)臨床懷疑線粒體病的患者，應(yīng)重視對(duì)SSVs的觀察，避免漏診。此外，部分ND基因突變患者的肌肉活檢可以完全正常，因此在肌肉活檢正常而臨床又高度懷疑線粒體病時(shí)，應(yīng)優(yōu)先篩查有無(wú)mtDNA編碼的ND基因的突變。

圖1 例1、例3、例4的頭部MRI表現(xiàn)

圖2 PCR-RFLP分析法驗(yàn)證例1-3及其部分家系成員的mtDNA突變結(jié)果

圖3 mtDNA全長(zhǎng)測(cè)序證實(shí)例4存在mtDNA單一大片段缺失(13025-13033:14417-14425)

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