高效液相色譜法測定人血漿頭孢米諾鈉濃度

鄭厚林，陳陽建

(1.浙江省寧波市醫療中心李惠利醫院藥劑科，315040;2.浙江醫藥高等專科學校，寧波315100)

頭孢米諾鈉的含量測定方法多有報道[1-3]，但有關其血漿濃度測定的文獻報道[4]并不多見，筆者在參考相關文獻的基礎上，建立了一種操作簡便、快速、準確，并適用于臨床上頭孢米諾鈉血漿濃度的測定及藥動學研究的反相高效液相色譜法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器日本島津高效液相色譜儀，包括LC-10Advp型泵、SPD-10A型紫外檢測器和CTO-10AS型柱溫箱;N-3000色譜工作站(浙江大學智達信息工程研究所)。WX-80A旋渦儀(上海醫科大學儀器廠)，TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，AB204-A電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器公司)，PHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠生產)。

1.2 試藥頭孢米諾鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:130508-200301，含量:77.4%)，阿司匹林對照品(沈陽萬隆制藥廠，批號:20090318，含量:99.0%)，注射用頭孢米諾鈉(山東魯抗醫藥股份有限公司，批號:090607，規格:每瓶1.0 g)，0.9%氯化鈉注射液(上海百特醫療用品有限公司，批號:S0907103，規格:250 mL∶2.25 g)，甲醇為色譜純，冰醋酸、醋酸銨、高氯酸均為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 頭孢米諾鈉對照品貯備液的配制精密稱取頭孢米諾鈉對照品129.2 mg置于100 mL容量瓶，加流動相溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg·mL-1頭孢米諾鈉對照品貯備液，并于4℃保存。臨用前用純化水稀釋至相應濃度即可。

2.1.2 內標溶液的配制精密稱取阿司匹林對照品100 mg，置于100 mL容量瓶，加少量甲醇溶解，然后用流動相稀釋定容至100 mL，得到1.0 mg·mL-1內標貯備液，并于4℃保存。準確移取內標貯備液2.0 mL，置于10 mL量瓶，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即為200 μg·mL-1內標溶液。

2.2 色譜條件色譜柱:Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:20 mmol·L-1醋酸銨溶液(加冰醋酸調節pH至4.50)-甲醇-0.1%三乙胺(85∶10∶5);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;檢測波長:254 nm。空白血漿、血漿樣品和頭孢米諾鈉標準品及內標的色譜圖見圖1。

圖1 3種溶液高效液相色譜圖

由圖1可知，頭孢米諾鈉和內標色譜峰均不受血漿中內源性雜質的干擾，且兩者能夠完全分離，頭孢米諾鈉和內標的保留時間分別為4.7和6.9 min。

2.3 血漿樣品的預處理取血漿400 μL，置于1.5 mL具塞離心管，分別加內標溶液100 μL和10%高氯酸溶液250μL，渦旋振蕩混勻2min，15 000 r·min-1離心8 min(離心半徑:6 cm)，取上清液20 μL進樣。

2.4 標準曲線與最低檢測限取空白血漿400 μL，加頭孢米諾鈉對照品貯備液適量，分別配制成0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0，200.0 μg·mL-1血漿樣品溶液，按“2.3”項操作，進行色譜分析，以頭孢米諾鈉/內標峰面積的比值(Y)對頭孢米諾鈉濃度(C)進行加權(W=1/C2)線性回歸，上述各濃度對應的Y值分別為0.081，0.132，0.315，0.533，1.192，2.881，5.823，11.023，22.718 μg·mL-1，得回歸方程為Y=0.021+0.113C(r=0.999 7，n=9)。結果表明，頭孢米諾鈉在0.5～200.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好，最低檢測限0.5 μg·mL-1(S/N≥3)。

2.5 精密度實驗取空白血漿400 μL，準確配制頭孢米諾鈉濃度為1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的標準血漿樣品各5份，按“2.3”項下操作，于同日內及連續3 d測定，所得結果代入回歸方程，分別計算日內及日間精密度，結果見表1。

表1 日內及日間精密度實驗結果±s

表1 日內及日間精密度實驗結果±s

加入量/(μg·mL－1)日內精密度測得量/(μg·mL－1)RSD/RSD/%日間精密度測得量/(μg·mL－1)%1.00.97±0.055.160.95±0.077.37 10.09.86±0.424.269.82±0.464.69 100.099.78±1.581.59100.42±2.362.36

2.6 回收率實驗

2.6.1 提取回收率實驗準確配制頭孢米諾鈉濃度為1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的標準血漿樣品各5份，按“2.3”項操作，所得峰面積(A1)與相應濃度的頭孢米諾鈉對照品溶液直接進樣所得峰面積(A2)進行比較。回收率(%)=A1/A2×100%，計算提取回收率，結果見表2。

2.6.2 方法回收率實驗準確配制含頭孢米諾鈉濃度為1.0，10.0，100.0 μg·mL-1的標準血漿樣品各5份，按“2.3”項操作，以頭孢米諾鈉測得量與實際加入量的比值計算方法回收率，結果見表2。平均提取回收率83.20%，RSD=3.35%;平均方法回收率98.51%，RSD=1.37%。

表2 頭孢米諾鈉回收率實驗結果 %，±s，n=5

表2 頭孢米諾鈉回收率實驗結果 %，±s，n=5

濃度/(μg·mL－1)提取回收率方法回收率1.080.1997.11 10.083.7498.63 100.085.6799.78

2.7 穩定性實驗取空白血漿400 μL，準確配制頭孢米諾鈉濃度為1.0，10.0，100.0 μg·mL-1標準血漿樣品，按“2.3”項操作，以最初的測量值為100%，每個樣品重復測量3次，分別考察血漿樣品在室溫放置2，24 h;血漿樣品于－20℃冷凍24 h后室溫下解凍并反復凍融3次;以及血漿樣品于－20℃冷凍30 d的長期穩定性，結果見表3。

表3 頭孢米諾鈉穩定性實驗結果μg·mL-1，±s

表3 頭孢米諾鈉穩定性實驗結果μg·mL-1，±s

濃度室溫2 h穩定性室溫24 h穩定性凍融穩定性(反復凍融3次)長期穩定性(－20℃，30 d)1.01.01±0.040.97±0.060.87±0.050.94±0.05 10.09.90±0.389.86±0.549.58±0.619.78±0.47 100.0100.88±2.31100.32±3.4694.87±4.7998.38±3.86

3 討論

筆者在選擇流動相時分別考察了20 mmol·L-1醋酸銨溶液與甲醇的比例以及流動相的pH對色譜分離效果的影響，按不同配比均發現頭孢米諾鈉的峰拖尾，峰形不對稱，因此加入少量三乙胺。最終確定流動相為20 mmol·L-1醋酸銨溶液(加冰醋酸調節pH至4.50)-甲醇-0.1%三乙胺(85∶10∶5)，樣品峰與內標峰、雜質峰均可完全分離并且無拖尾現象。

實驗結果表明，10%高氯酸沉淀蛋白的效果明顯好于10%和20%的三氯乙酸，沉淀完全且雜質較少，乙腈的血漿蛋白結合率相對較低且毒性較大，故選用10%高氯酸作為血漿樣品處理的蛋白沉淀劑。

在內標物的選擇上，曾參考相關文獻[3-4]，采用對乙酰氨基酚、鄰硝基苯甲酸和阿司匹林等作為內標，采用對乙酰氨基酚或鄰硝基苯甲酸的分離效果并不理想，且出峰時間較長，阿司匹林作為內標物，能夠得到較好的分離效果，內源性物質不干擾，且保留時間較短，縮短了分析周期，可提高樣品的測定效率。

[1]吳慶歡，陳彩云，伍俊妍，等.注射用頭孢米諾鈉的含量測定及配伍穩定性觀察[J].中國藥物與臨床，2007，7(7):545－546.

[2]封家福，張錦，代廣會，等.反相高效液相色譜法測定注射用頭孢米諾鈉含量及其有關物質[J].中國藥業，2006，15(10):14－15.

[3]張濤.高效液相色譜法測定注射用頭孢米諾鈉的含量[J].天津藥學，2006，18(5):14－16.

[4]段威，夏東亞，郭濤.HPLC法測定人血漿中頭孢吡肟的濃度[J].中國藥房，2008，19(29):2262－2264.