Optiprep法分離大鼠肝星狀細胞的實驗研究

余盼攀，張勝初，季世強，蘇龍豐，張啟瑜

（溫州醫學院附屬第一醫院 肝膽外科，浙江 溫州 325035）

Knook等[1]在1982年采用膠原酶、鏈霉蛋白酶原位循環灌注法首先成功地分離出大鼠肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC），標志著HSC研究的開始。HSC是目前肝纖維化研究的一個關鍵點。活化的HSC能分泌細胞外基質及多種細胞因子，在肝纖維化發生、發展及轉歸中扮演了重要的角色。原代HSC和體外活化的細胞株具有不同的生物學特點，原代HSC適合靜止HSC的生物學特性的研究。體內絕大部分HSC是以靜止狀態存在，所以對原代HSC的研究更有實際意義。原代HSC的分離難度大，成功率低，建立一種合理、經濟、便捷的分離方法實屬必要。本研究在國內外大鼠HSC分離培養基礎上采用改良的Optiprep密度梯度離心法成功分離出大鼠HSC，現介紹如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體質量500～600 g，由溫州醫學院動物實驗中心提供，常規喂養，術前12 h禁食。

1.2 試劑及儀器 IV型膠原酶（type IV collagenase）、DNA酶I（DNaseI）、D-Hanks液均購自美國Sigma公司，Optiprep分離遞質購自挪威Axis-shield公司。DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。大鼠α-SMA單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG二抗購自武漢博士德公司。倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，高速離心機購自美國Beckman公司。

1.3 分離用液 前灌注液：D-Hanks液500 mL+肝素鈉1 mL預熱至37 ℃。酶灌注液：Hanks 100 mL+IV型膠原酶0.05 g+DNA酶I 0.03 g預熱至37 ℃。震蕩消化液：同酶灌注液。終止消化液：DMEM培養液10 mL+胎牛血清5 mL預冷至4 ℃。細胞洗滌液：Hanks 50 mL+DNA酶I 0.02 g。離心液：10%離心液（60% Optiprep原液0.8 mL+D-Hanks液4.17 mL）；16%離心液（60% Optiprep原液1.5 mL+D-Hanks液3.5 mL）。各液體中分別加入1%青鏈霉素。

1.4 分離方法

1.4.1 原位消化：大鼠經3%戊巴比妥鈉30 mg/mL麻醉后，固定于操作臺上，腹部備皮，75%酒精消毒后取大十字切口進腹。肝臟稍作分離，顯露肝上下腔靜脈同時游離肝下下腔靜脈帶線備用。游離門靜脈主干1.5 cm帶線備用，側支予以結扎。血管夾夾閉門靜脈遠端，近端置18號留置針并固定，同時夾閉肝上下腔靜脈，剪開肝下下腔靜脈，用50 mL針筒緩慢推注前灌注液。

1.4.2 離體消化：當肝臟表面顏色變為灰白時迅速游離肝臟置于無菌小彎盤。換酶灌注液繼續灌注10 min，待肝包膜下肝組織完全軟化幾乎成液體時停止消化。

1.4.3 細胞分散及純化：將肝臟轉移至無菌培養皿中，剪開包膜，剔除結締組織，剪碎肝組織放入50 mL離心管中加入震蕩消化液于37 ℃震蕩消化20 min，結束后加入15 mL終止消化液。所得細胞懸液經200目濾網過濾2次，移入2個50 mL離心管中，加入細胞洗滌液充分吹打分散細胞。65 g離心10 min去除肝細胞，上清分別移入2只50 mL離心管中，500 g離心10 min，取沉淀。2管合為1管，用40 mL細胞洗滌液重懸細胞，再次500 g離心10 min，取沉淀。

1.4.4 Optiprep密度梯度離心：上述細胞沉淀加入16% Optiprep 5 mL重懸，終濃度為12%，再輕輕上覆10% Optiprep 5 mL，再以同樣的方法上覆5 mL D-Hanks液，于4 ℃ 1400 g密度梯度離心17 min，輕輕取出離心管，用玻璃注射器小心吸出上層D-Hanks液與10% Optiprep液界面灰白色的細胞條帶，用洗滌液以500 g，7 min漂洗2次，用含20%胎牛血清的DMEM重懸細胞，移出部分用于細胞鑒定外其余移入培養瓶中，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。

1.5 鑒定方法

1.5.1 新鮮HSC產量的測定：倒置相差顯微鏡下，用血細胞計數板計算細胞產量。

1.5.2 活細胞率鑒定方法：臺盼藍排斥反應：取細胞懸液90μL加入0.4%臺盼藍10μL后滴加到載玻片上，顯微鏡下計算未染色的活細胞數。

1.5.3 性質鑒定方法：熒光顯微鏡下觀察當激發波長為328 nm時出現自發熒光的細胞即為新鮮分離的肝星狀細胞。六孔板中放入在蓋玻片，待細胞爬片后采用α-SMA免疫細胞化學法鑒定。

1.6 培養及傳代方法 將細胞以5×105/mL接種于25 mL培養瓶中，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養，24 h后首次換液去除未貼壁的細胞。以后每2～3天換液一次，待細胞長滿瓶底時0.25%胰酶消化傳代。

2 結果

2.1 HSC的形態觀察 在熒光顯微鏡下能見到新鮮分離細胞的自發淡藍色熒光，見圖1。在相差顯微鏡下，新分離的HSC呈圓形，具有很強的折光性，體積明顯小于肝細胞，見圖2。接種30 min即可出現貼壁，培養24 h后細胞90%貼壁，多呈紡錘形、多角形。培養至5 d左右細胞外觀呈現出明顯的星形，胞漿內顆粒減少，細胞逐漸融合成片狀生長，見圖3。培養至14 d細胞全部活化，胞漿內脂滴基本消失，體積增大。

圖1 新鮮分離的HSC自發熒光（×400）

圖2 新鮮分離的HSC（×100）

圖3 體外培養5 d的HSC（×200）

圖4 傳5代后HSCα-SMA染色（SABC，×200）

2.2 HSC的得率和存活率 采用Optiprep密度梯度離心法分離SD大鼠肝星狀細胞，大鼠平均每只重500 g，平均得率為2×107個/肝。經0.4%臺盼藍染色，細胞存活率在90%以上。

2.3 HSC純度鑒定 α-SMA免疫細胞化學染色顯示，新鮮分離的肝星狀細胞α-SMA染色陰性，傳5代后α-SMA陽性細胞達95%以上，見圖4。

3 討論

HSC是四種肝臟非實質細胞的一種，首先由Kuffer在1876年發現。1996年美國肝病會議將其統一命名為肝星狀細胞（HSC）[2]。目前大量的抗纖維化研究都是圍繞著HSC的增殖、凋亡、轉歸而開展的[3]。靜止的HSC在體外能迅速活化，所以要研究靜止HSC的生物學特性必須采用新鮮分離的HSC。國內外關于大鼠HSC分離培養的方法報道甚多[4-8]，但也有一些不足，如單用原位循環灌注酶液雖然操作簡單，但由于肝臟與鄰近器官側支循環豐富，這樣不但增加酶的用量，增加分離成本，而且酶容易經側支循環流向其他器官而影響灌注的效果；鏈酶蛋白酶雖然可以去除部分肝細胞，提高星狀細胞純度，但對星狀細胞亦有較大的損傷；采用蠕動泵灌注雖然速度壓力較均勻，但起初灌注時需要較高的壓力迅速沖洗肝臟內血液及其他雜質，而當灌注酶液時由于酶與肝細胞需要一定的反應時間，此時則需要較低的灌注壓。我們經過反復實驗總結出影響HSC得率、純度、活力的主要因素及改進方法，介紹如下：

3.1 實驗動物的選擇 實驗動物體質量要大于400 g，并且營養狀況要好，這樣才能保證有足夠的細胞數并且使HSC含有更多的脂滴，有利于密度梯度的形成。術前1個月給予每周兩次腹腔注射維生素A對密度梯度的形成有一定的幫助。

3.2 酶的類型及濃度 我們僅使用IV型膠原酶和DNA酶I而沒有使用鏈酶蛋白酶，發現HSC得率并沒有明顯下降反而細胞活力有所提高，說明鏈酶蛋白酶并非必需。在配置各種液體時要確保濃度準確，若酶濃度過高則對細胞的損傷大，若過低則達不到充分消化的目的，影響HSC的得率。值得注意的是，對各種實驗用液要在實驗前預冷或預熱到適當溫度，以保證達到最佳的效果。

3.3 合適的灌注壓力及消化時間 必須掌握好合適的灌注壓。若壓力過大，細胞容易發生機械損傷，若過小則延長實驗時間亦會影響細胞的活力。我們在實驗中采用注射器人工推注的方法根據實際推注時阻力大小調整灌注速度和壓力（約10～15 mL/min）提高了灌注效率，減少細胞損傷，取得較好效果。灌注、震蕩消化時間尤為重要。我們通過反復實驗得出離體灌注酶液約10 min后剪碎肝組織后再37 ℃震蕩消化20 min效果最好。

3.4 肝臟的處理 在游離肝臟時應盡量結扎除肝下下腔靜脈外所有與外界相通的管道，并且避免肝臟損傷，這樣才能保證整個肝臟灌注均勻、完全。值得一提的是，離體灌注結束后用組織剪先剔除肝包膜及肝內血管、膽管以減少雜質的混雜，而后剪碎肝組織，確保能充分消化以提高細胞得率。

3.5 分離遞質的選擇及配置 高質量的分離遞質是HSC分離成功的關鍵因素。目前國內學者多采用Percol或Nycodenz作為分離遞質，我們通過預實驗發現Percol雖然價格較低，但很難形成明顯的細胞條帶。Nycodenz為固體，溶解度小，配置過程容易污染且濃度誤差較大。因此我們采用Optiprep作為分離遞質，發現與Percol、Nycodenz相比其對細胞損傷較小，液體配置更加簡便、準確且細胞條帶更明顯，細胞純度、得率亦較高。重要的是分離用液必須現用現配，配之前必須充分混勻原液，以避免密度不均。我們采用D-Hanks液稀釋60% Optiprep至10%、16%，加10% Optiprep和最上層D-Hanks時一定要沿管壁慢慢流下，保證加完以后能形成明顯的分層。

3.6 密度梯度的形成及細胞獲取 密度梯度的形成除優質的分離遞質外離心機的正確使用至關重要，離心時務必將離心機調成慢制動狀態，并且溫度設置為4 ℃，避免快速制動后層面發生混雜及溫度過高影響細胞活性。離心完取細胞條帶時盡量保持注射器垂直，緩慢向上吸取細胞層，避免過快時吸到層面下的Kupffer細胞影響HSC的純度。

當然整個分離過程必須保證嚴格無菌，操作過程必須熟練，盡量縮短分離時間，否則影響細胞活力。

綜上所述，我們采用原位預灌注含肝素的DHanks液后再離體灌注IV型膠原酶和DNA酶I，不僅大大節省了酶的用量，而且使得灌注更加完全、均勻。此方法提取的HSC產量、純度、活力都達到甚至超過了之前的分離方法，并且操作簡便，費用較低，可以作為一種合理、經濟、便捷的HSC提取方法。

[1] Knook DL, Seffelaar AM, Delleuw AM. Fat-storing cells of the rat liver:their isolation and purification[J]. Exp Cell Res,1982,139(2):468-471.

[2] Ahernmn M, Hall P, Halliday J, et al. Hepatic stellate cell nomenclature[J]. Hepatology,1996,23(1):193-193.

[3] Wang X, Tang X, Gong X, et al. Regulation of hepatic stellate cell activation and growth by transcription factor myocyte enhancerfactor 2[J]. Gastroenterology,2004,127(4):1174- 1188.

[4] 翁山耕, 冷希圣, 魏玉華. 改良法大鼠肝星狀細胞的分離培養及鑒定[J].北京大學學報：醫學版,2001,33(1):83-86.

[5] Friedman SL, Roll FJ. Isolation and culture of hepatic lipocytes ,kupffer cells,and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with stractan[J]. Anal Biolchem,1987,161(1):207-218.

[6] Ramm GA. Isolation and culture of rat hepatic stellate cells[J]. J Gastroenterol Hepatol,1998,13(8):846-851.

[7] 王文兵, 戴立里, 鄭元義. 改良原位循環灌流法大鼠肝星狀細胞分離培養及鑒定[J]. 中華肝臟病雜志,2004,12(10):629-630.

[8] 羅云, 戴立里, 沈鼎明,等. 原位循環灌流法分離大鼠肝星狀細胞[J].重慶醫科大學學報,2002,27(1):48-49.