甲型副傷寒桿菌重組蛋白Omp W的表達與鑒定＊

林飛飛，馮康樂，雷銀蕉，戎春浩，盛 思，阮 萍

沙門菌（Salmonella）是一類兼性胞內寄生菌。沙門菌血清型眾多，其中傷寒沙門菌和副傷寒沙門菌感染引起的傷寒和副傷寒是發展中國家高發的腸道傳染病，每年導致近60萬人死亡，我國每年報告傷寒及副傷寒病例數近2萬例。近年來，甲型副傷寒沙門菌在我國開始流行，在一些省或自治區人群中超過傷寒沙門菌而成為優勢菌型［1－2］，且甲型副傷寒沙門菌耐藥性逐年增強。目前我國普遍采用以莢膜多糖為抗原的Vi疫苗來預防傷寒或副傷寒，但甲型副傷寒桿菌無多糖莢膜，故Vi疫苗無預防甲型副傷寒效果［3］。因此，篩選甲型副傷寒桿菌保護性表面蛋白抗原，進而研制甲型副傷寒疫苗，對于預防和控制甲型副傷寒的流行具有重要意義。

外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）通常是沙門菌等革蘭陰性細菌主要表面抗原之一。根據甲型副傷寒桿菌全基因組序列［4］，該菌至少有21個OMP編碼基因，其中肯定的主要OMPs有spaO、omp A、omp C、omp N、ompS、omp W、nmp C等，根據查閱文獻，spaO、omp A和nmp C等已有報道或正在研究之中，故根據甲副傷寒桿菌ATCC9150株全基因組序列中對omp W基因產物“Surface antigen”的詮釋，我們選擇了omp W作為研究對象，進行其基因產物的研究。本研究中，我們檢測了我國甲型副傷寒桿菌臨床菌株中omp W基因攜帶率，構建了omp W基因原核表達系統并鑒定了重組表達產物r Omp W的免疫原性，以期為r Omp W用作甲型副傷寒桿菌基因工程疫苗抗原提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及培養 甲型副傷寒桿菌參考標準株50001購自北京中國藥品生物制品檢定所。95株分離自患者并經系統細菌學鑒定的甲型副傷寒桿菌株由浙江省寧波市和溫嶺市疾病預防控制中心提供。上述菌株采用細菌營養肉湯或其瓊脂（Oxoid）培養。原核表達載體p ET42a－E.coliBL21DE3由浙江大學醫學院嚴杰教授惠贈。

1.2 PCR 采用細菌基因組DNA提取試劑盒（BioColor）提取上述菌株基因組 DNA，提取的DNA并溶于TE緩沖液中，采用分光光度法測定DNA濃度和純度。根據GenBank中omp W基因序列以及限制性核酸內切酶位點分析結果，自行設計擴增全長omp W基因的PCR引物：上游5’－GCG CAT ATG （NdeI）GTG GCG GCA CAG GCG TT－3’，下游5’－GCG CTC GAG （XhoI）GAA ACG ATA GCC TGC CGA－3’。PCR引物由上海Introvigen公司合成。PCR總體積100μL，內含2.5 mol/L各d NTP、250 nmol/L各引物、2.5 U Taq－Pfu DNA聚合酶混合物、100 ng DNA模板和1×PCR緩沖液（TaKaRa）。PCR參數：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，30個循環；72 ℃10 min。采用1μg/m L溴乙錠預染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，目的產物預期大小為624 bp。

1.3 T－A克隆和原核表達系統構建 采用T－A克隆試劑盒（BioDev－Tech）將甲型副傷寒桿菌JH01臨床菌株omp W基因擴增片段克隆至PMD18－T中形成重組質粒PMD18－TompW，轉化入E.coliDH5α并在LB培養液（Oxoid）中擴增，采用小量質粒試劑提取盒（BioDev－Tech）提取質粒，委托上海Introvigen公司測序。分別將PMD18－TompW及原核表達載體p ET42a（Novagen）用核酸內切酶NdeI和XhoI（TaKaRa）雙酶切，回收的omp W基因片段與線性化p ET42a用T4 DNA連接酶（Ta KaRa）連接形成重組表達載體p ET42aompW。將p ET42aompW轉化入表達宿主菌E.coliBL21DE3（Novagen）形成E.coliBL21DE3pET42a－ompW，該重組工程菌在LB培養液中擴增后提取質粒再次測序。

1.4 目的重組蛋白表達和免疫原性鑒定 采用分別含0.1和0.5 mmol/L異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG，Sigma）的LB培養液，37℃震蕩培養4 h，以誘導E.coliBL21DE3pET42a－ompW表達目的重組蛋白r Omp W。用12%分離膠的 SDS－PAGE（Sigma）和Bio－Rad凝膠圖象分析系統檢查r Omp W表達情況及產量，采用 Ni－NTA親和層析柱（BioColor）提純r Omp W。將1 mg r Omp W與弗氏完全佐劑混合后背部皮內免疫家兔4次，每次間隔1 w，末次免疫后2 w采集心血并分離血清，采用免疫雙擴散法檢測抗血清的效價。分別以1∶200稀釋的r Omp W兔抗血清和1∶500稀釋的自制甲型副傷寒桿菌50001株全菌兔抗血清為一抗，1∶3 000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG（Jackson Immuno Research）為二抗，采用Western Blot檢測r Omp W的抗原性和免疫反應性。

1.5 臨床菌株omp W基因攜帶率檢測 按上法采用PCR檢測95株甲型副傷寒桿菌臨床菌株omp W基因的攜帶情況。

2 結 果

2.1 PCR檢測結果 甲型副傷寒桿菌50001株及JH01株基因組DNA中均擴增出預期大小的omp W基因片段（圖1）。

圖1 甲型副傷寒桿菌菌株中擴增的ompW基因目的條帶Fig.1 The amplification fragments of target gene and DNA segmentsM：marker（Biocolor）；Lane 1：the blank control；Lane 2 and 3：the amplification fragments of the omp W genes from a S.paratyphi A strain 50001 and No.JH01，respectively.

2.2 序列分析結果 與報道的omp W基因序列（Gen Bank No.：CP000026）比較，甲型副傷寒桿菌50001株及包括JH01株在內的10株甲型副傷寒桿菌臨床菌株omp W基因核苷酸和氨基酸序列相似性均為100%。PMD18－TompW與p ET42aompW中插入的omp W基因基因序列完全相同。上述序列比較時不包括引物序列。

2.3 r Omp W表達和提純效果 IPTG能有效地誘導E.coliBL21DE3pET42a－ompW表 達r Omp W，其 表 達量約占細菌總蛋白的25%，Ni－NTA親和層析法提純的r Omp W在分離膠中顯示為單一的蛋白條帶。

2.4 r Omp W的抗原性和免疫反應性 r Omp W能免疫家兔后能產生抗體。Western blot結果證實，甲型副傷寒桿菌全菌抗血清及兔抗r Omp W血清均能識別r Omp W并產生陽性反應。

2.5 臨床菌株omp W基因攜帶率 PCR結果顯示，所有甲型副傷寒桿菌臨床菌株（95/95）均攜帶omp W基因。

3 討 論

OMP是革蘭陰性菌主要表面蛋白抗原。有研究證實，沙門菌OMP可有效地誘導機體產生淋巴細胞增殖反應［5－6］，一些副傷寒桿菌OMP可誘導患者或實驗感染動物中產生高效價抗體［7－8］。2004年，McClelland等報告了甲副傷寒桿菌ATCC9150株全基因組序列［4］，至少有二十個明確的OMPs或推測的OMPs基因得到詮釋，其中肯定的甲副傷寒桿菌主要 OMPs有spaO、omp A、ompC、omp N、ompS、omp W、nmp C，這為研究甲副傷寒桿菌OMPs及其免疫性提供了堅實的基礎。眾所周知，與抗原構造較為簡單的病毒不同，細菌是抗原構造復雜多樣的原核細胞型微生物，單一細菌OMP抗原的抗體作用靶點極為有限，難以獲得理想的免疫保護效果，故至今從未有以單一蛋白抗原。我們認為，必須采用多種細菌表面蛋白同時作為免疫原，才有可能獲得良好的免疫保護效果。因此，在甲型副傷寒桿菌SpaO、Omp A、H1a和nmp C抗原研究基礎上［9－11］，根 據 甲 副 傷 寒 桿 菌 全 基 因 組 序 列 中 對omp W基因產物“Surface antigen”的詮釋，進一步研究了其基因產物，以期獲得更多的多價基因工程疫苗候選抗原。

本研究中，我們采用PCR和T－A克隆法從甲型副傷寒桿菌50001株及包括JH01株在內的10株甲型副傷寒桿菌臨床菌株omp W基因克隆。與報 道 的omp W基 因 序 列 （GenBank No.：CP000026）比較，上述克隆的甲型副傷寒桿菌omp W基因核苷酸和氨基酸序列相似性均為100%，表明omp W基因序列極為保守。r Omp W免疫家兔后能產生特異性抗體，r Omp W不僅能與其抗血清結合，也能與甲型副傷寒桿菌全菌抗血清發生免疫反應，表明r Omp W具有良好的抗原性和免疫反應性。此外，蛋白抗原基因在不同來源菌株中分布廣泛，也是確定其能否作為基因工程疫苗候選抗原的基本條件之一。我們的PCR結果顯示，所有受試的95株甲型副傷寒桿菌臨床菌株均攜帶omp W基因。上述結果提示，Omp W為甲型副傷寒桿菌分布廣泛且自然表達的外膜蛋白，可作為多價基因工程疫苗的候選抗原。

［1］秦淑文，陳恩富，謝淑云，等.2004－2006年浙江省沿海地區傷寒副傷寒疫情及監測結果分析［J］.中國預防醫學雜志，2008，9（4）：284－286.

［2］儲從家，孔繁林，吳惠玲，等.3888例甲型副傷寒流行病學調查［J］.云南醫藥，2008，29（1）：57.

［3］Parry CM，Hhien TT，Dougan G，et al.Typhoid fever［J］.N Engl J Med，2002，347（22）：1770－1782.

［4］McClelland M，Sanderson KE，Clifton SW，et al.Comparison of genome degradation in Paratyphi A and Thphi，human－restricted serovars ofSalmonnellaentericathat cause typhoid［J］.Nat Genet，2004，36：1268－1274.

［5］Gonzalez CR，Isibasi A，Ortiz－Navarrete V，et al.Lymphocytic proliferative response to outer membrane protein isolated fromSamonella［J］.J Microbiol Immunol，1993，37：793－799.

［6］McSorley SJ，Cookson BT，Jenkins MK，et al.Characterization of CD4＋cell responses during natural infection withSalmonella typhimurium［J］.J Immunol，2000，164：986－993.

［7］Korbsrisate S，Sarasombath S，Ekpo P，et al.Molecular cloning and expression ofSalmonellaparatyphiA 52 kDa specific protein gene［J］.Asian Pac J Allergy Immunol，1994，12：27－37.

［8］Jeannin P，Magistrelli G，Goestsch L，et al.Outer membrane protein A（Omp A）：a new pathogen－associated molecular pattern that interacts with antigen presenting cells－impact on vaccine strategies［J］.Vaccine，2002，20：A23－A27.

［9?Ruan P，Xia XP，Sun D，et al.Recombinant SpaO and H1a as immunogens for protection of mice from lethal infection withSalmonellaparatyphiA：Implications for rational design of typhoid fever vaccines［J］.Vaccine，2008，26：6639－6644.

［10］蔣錦琴，阮萍，丁威，等.甲型副傷寒桿菌omp A基因分布及重組表達產物的免疫學鑒定［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2010，30（1）：1－5.

［11］吳穎，王艷芳，嚴杰，等.甲型副傷寒桿菌nmpC基因原核表達及表達產物免疫保護作用［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2010，30（12）：1118－1123.