阪崎腸桿菌實時熒光雙重TaqMan PCR快速檢測體系的建立＊

孟 雙，李 娟，王 艷，白雪梅，葉長蕓

阪崎腸桿菌實時熒光雙重TaqMan PCR快速檢測體系的建立＊

孟 雙，李 娟，王 艷，白雪梅，葉長蕓

目的 建立針對阪崎腸桿菌的高靈敏、高特異的實時熒光雙重TaqMan聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）快速檢測體系。方法 根據(jù)阪崎腸桿菌基因組16SrRNA～23SrRNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因和外膜蛋白A（OmpA）基因的特異性序列設(shè)計引物及TaqMan探針，利用高通量實時熒光PCR檢測平臺探討該檢測體系的靈敏度；用50種其他腸道致病菌及院內(nèi)感染中常見的致病菌評價該檢測體系的特異性。結(jié)果 實時熒光雙重TaqMan PCR快速檢測體系對阪崎腸桿菌重組質(zhì)粒的檢測靈敏度為1×102拷貝/反應(yīng)體系；對阪崎腸桿菌基因組的檢測靈敏度為4×10－1pg/反應(yīng)體系；該檢測體系在檢測50種其他腸道致病菌及院內(nèi)感染中常見的致病菌時未出現(xiàn)特異性擴增，整個反應(yīng)在2h內(nèi)完成。結(jié)論 本研究建立的實時熒光雙重TaqMan PCR檢測體系可作為阪崎腸桿菌靈敏、特異、快速的檢測方法，并同時檢測阪崎腸桿菌的致病力。

阪崎腸桿菌；實時熒光TaqMan PCR；外膜蛋白A；內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

阪崎腸桿菌是一種革蘭陰性、有周生鞭毛、能運動、兼性厭氧的無芽孢桿菌，起初被認為是陰溝腸桿菌的生物變型菌。后來Farmer［1］通過DNA雜交實驗以及菌株的生化特性等特征將其重新命名為阪崎腸桿菌，并劃分為克羅諾桿菌屬（Cronobacterspp）。

作為一種重要的條件致病菌，阪崎腸桿菌感染的大多數(shù)病例都是嬰兒，特別是早產(chǎn)兒、出生體重偏低等身體狀況較差的新生兒。感染主要引起腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎［2］。細菌表面的外膜蛋白A（ompA）在阪崎腸桿菌的致病過程中發(fā)揮了重要作用［3］。

由于傳統(tǒng)的阪崎腸桿菌檢測方法費事費力，不利于快速檢測，近年來針對阪崎腸桿菌基因組的快速檢測技術(shù)開始出現(xiàn)。為了既能有效的檢測阪崎腸桿菌，又能同時判斷阪崎腸桿菌表達OmpA及產(chǎn)生致病性的能力，在研究中我們選擇了阪崎腸桿菌的16SrDNA與23SrDNA之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）以及細菌的ompA基因作為檢測的靶標，建立了阪崎腸桿菌高靈敏、高特異的實時熒光雙重TaqMan PCR快速檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 阪崎腸桿菌標準株（ATCC51329）購自中國藥品生物制品檢定所。20株分離菌株為本室保存，經(jīng)過德靈 WALKAWAY－40SI全自動微生物分析儀鑒定。用于特異性評價的菌株由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所各科室提供，包括腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸集聚性大腸桿菌（EaggEC）、泌尿道致病性大腸桿菌（UPEC）、福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、甲型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、摩根氏摩根菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌、牛鏈球菌、糞腸球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、銅綠假單胞菌、嗜水氣單胞菌、單增李斯特菌。

1.1.2 試劑與儀器設(shè)備 Premix Ex TaqTM、EasyDilution、pMD18－T載體、JM109感受態(tài)細胞、Ex Taq DNA聚合酶以及小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。細菌基因組DNA抽提試劑盒購自Promega公司。ABI 7900HT PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的合成 利用GenBank的Blast工具對阪崎腸桿菌的ITS基因和ompA基因序列進行分析，選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測靶標序列，并針對這兩個序列設(shè)計引物和探針（見表1）。引物和探針均由上海基康生物公司合成。

1.2.2 細菌基因組DNA的抽提 細菌基因組DNA的抽提使用TAKARA公司的MiniBEST試劑盒，按照說明書進行操作。利用紫外分光光度計測定細菌基因組DNA的純度和濃度，阪崎腸桿菌基因組DNA用EasyDilution緩沖液稀釋至4×105～4×10－2pg/μL的濃度梯度，陰性對照用EasyDilution緩沖液稀釋至4×104pg/μL，各種基因組DNA均少量分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物及探針序列Table 1 Sequences primers and probes

1.2.3 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建與制備 ①以ITS－F/ITS－R和ompA－F/ompA－R為引物，分別進行PCR擴增后得到目的片段98bp和140bp；②切膠回收，純化PCR產(chǎn)物；③連接到T載體；④轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞；⑤篩選陽性克隆子，用PCR進行驗證，最終測序確認；⑥提取質(zhì)粒，根據(jù)質(zhì)粒的分子量將質(zhì)粒樣品濃度換算為拷貝數(shù)濃度：每μL樣品中檢測基因的拷貝數(shù)＝濃度（ng/μL）×阿佛加德羅常數(shù)×10－9/（660×重組質(zhì)粒堿基數(shù)）；⑦用 EasyDilution將上述質(zhì)粒依次稀釋成1.0×100拷貝/μL～1.0×1010拷貝/μL，共11個濃度梯度。

1.2.4 普通雙重PCR反應(yīng)體系的建立 普通雙重PCR反應(yīng)總體系為30μL，含10×PCR緩沖液3μL、2.5mmol/L dNTPs各2μL、10μmol/L引物各1μL、模板DNA 1μL、ExTaq DNA聚合酶2.5 U，補加滅菌水至30μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃延伸5min。同時以去離子水代替模板DNA作為陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析結(jié)果。

1.2.5 實時熒光雙重TaqMan PCR反應(yīng)體系的建立 實時熒光雙重TaqMan PCR法反應(yīng)總體系為20μL，含2×Premix（Takara）Ex TaqTM10μL、10μmol/L的引物探針各0.4μL、DNA模板1μL，補加去離子水至20μL。在ABI 7900HT PCR儀上擴增并測定結(jié)果，PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性30s；95℃變性3s，60℃延伸30s，共40個循環(huán)。擴增結(jié)束后，扣除本底熒光信號后取同一閾值分析數(shù)據(jù)，確定各樣本的Ct（cycle threshold）值。

1.2.6 普通雙重PCR與實時熒光雙重TaqMan PCR檢測體系靈敏度的評價 取質(zhì)粒標準品每反應(yīng)體系100拷貝至1010拷貝，或者以4×10－2pg/μL至4×105pg/μL梯度濃度的阪崎腸桿菌基因組DNA為模板，評價普通雙重PCR與實時熒光雙重Taq－Man PCR檢測體系的檢測靈敏度。

1.2.7 檢測特異性評價 以常見致病菌及條件致病菌DNA（EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EaggEC、UPEC、福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、甲型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、摩根氏摩根菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌、牛鏈球菌、糞腸球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、銅綠假單胞菌、嗜水氣單胞菌、單增李斯特菌）為模板評價了實時熒光雙重TaqMan PCR體系的特異性。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因片段的克隆 實驗獲得的擴增片段分子量大小與預(yù)期結(jié)果一致，ITS基因的擴增片段長度為98bp，ompA基因的擴增片段長度為140 bp。將所得片段分別插入T載體中，經(jīng)測序驗證，所獲陽性克隆包含的目的片段序列完全正確。

2.2 普通雙重PCR檢測體系的靈敏度 雙質(zhì)粒梯度稀釋進行普通雙重PCR擴增后顯示：當每反應(yīng)體系中ITS基因重組質(zhì)粒和ompA基因重組質(zhì)粒的模板數(shù)降低至104拷貝以下時，普通PCR擴增后電泳圖上未出現(xiàn)目的條帶，陰性對照也未見擴增條帶（圖1）。

2.3 實時熒光雙重TaqMan PCR檢測體系的靈敏度 用與普通雙重PCR檢測體系相同的雙質(zhì)粒稀釋梯度作為模板進行實時熒光雙重PCR檢測后顯示：當ITS基因與ompA基因重組質(zhì)粒濃度為1.0×102～1.0×1010拷貝/μL時，其熒光信號強度高于檢測閾值，故其檢測范圍是1.0×102～1.0×1010拷貝每反應(yīng)體系（圖2）。在該雙重PCR檢測體系中，兩個靶基因擴增反應(yīng)的Ct值與模板濃度之間均存在良好的線性關(guān)系，ITS的相關(guān)性為0.991，ompA的相關(guān)性為0.994。

2.4 普通雙重PCR與實時熒光雙重TaqMan PCR體系對阪崎腸桿菌基因組的檢測靈敏度 將阪崎腸桿菌基因組DNA稀釋到4×10－2～4×105pg/μL進行普通雙重PCR擴增后結(jié)果顯示：當基因組DNA稀釋至每反應(yīng)體系4×101pg以下時普通雙重PCR擴增后電泳圖上未出現(xiàn)特異性擴增條帶（圖3）；用相同稀釋梯度的基因組DNA進行實時熒光雙重PCR擴增顯示：當基因組DNA濃度為4×10－1～4×105pg/μL時，其熒光信號強度高于檢測閾值，提示實時熒光雙重PCR檢測體系對阪崎腸桿菌基因組DNA的檢測靈敏度比普通雙重PCR高100倍（圖4）。

2.5 實時熒光雙重TaqMan PCR體系的檢測特異性 用該體系對EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EaggEC、UPEC、福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、甲型副傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、摩根氏摩根菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌、牛鏈球菌、糞腸球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、銅綠假單胞菌、嗜水氣單胞菌、單增李斯特菌等50種非阪崎腸桿菌的病原菌基因組DNA進行檢測時均未產(chǎn)生特異性擴增曲線，說明該檢測體系的特異性良好。

3 討 論

阪崎腸桿菌是一種新興的食源性病原菌，在新生兒特別是早產(chǎn)兒和免疫力低下的人群中可引起腦膜炎、敗血癥以及壞死性小腸結(jié)腸炎［2］。FDA推薦的分離鑒定阪崎腸桿菌的方法費時費力，不利于快速檢測。使用這些方法鑒定阪崎腸桿菌主要依靠菌株的一些生化特性以及色素的產(chǎn)生，但是一些阪崎腸桿菌并不產(chǎn)生黃色色素，因此就無法在TSA平板上分離，就容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果［4］。

與其他檢測方法相比，本研究建立的實時熒光雙重TaqMan PCR檢測體系具有許多的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要兩次增菌后用顯色培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，再進行生化鑒定，工作量大，耗時長。實時熒光雙重TaqMan PCR檢測體系在2h內(nèi)就可以觀察結(jié)果，滿足了臨床快速診斷的需要，且靈敏度遠高于培養(yǎng)方法，能監(jiān)測含菌量極低的食品以及臨床、環(huán)境樣本。普通PCR方法擴增完成后需制備瓊脂糖凝膠、電泳、染色和成像觀察，操作繁瑣，肉眼判斷條帶敏感性受限，擴增后開蓋容易引起產(chǎn)物污染［5］，而實時熒光PCR體系無需開蓋，擴增過程同步檢測熒光變化，探針分子雜交確保檢測更加特異，靈敏度提高2個數(shù)量級，可以實現(xiàn)定量檢測。通常單個靶位點的實時熒光PCR只能檢測一個基因，本研究建立的實時熒光雙重TaqMan PCR體系可以同時檢測ITS和ompA兩個基因。16SrDNA與23SrDNA之間的ITS序列是在細菌分類學上用的最多的靶標［6］。不同細菌種屬之間的ITS序列存在相應(yīng)的變化，因此ITS序列可以用來作為鑒定細菌種、屬的一個靶標基因［7］。細菌表面有多種外膜蛋白，其中ompA在阪崎腸桿菌的致病過程中發(fā)揮了重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)不表達外膜蛋白A的突變株（ompA－）對宿主細胞的侵入力和黏附作用比正常菌株低7倍，并且不能在人腦微血管內(nèi)皮細胞（HBMEC）中繁殖［3］。本研究采用實時熒光雙重TaqMan PCR體系在對阪崎腸桿菌檢測的同時還可以判斷其是否攜帶致病相關(guān)基因，可對檢測結(jié)果的判斷提供可靠的依據(jù)。

我們利用質(zhì)粒標準品和阪崎腸桿菌基因組DNA兩類模板，較全面的探討了普通雙重PCR、實時熒光雙重TaqMan PCR檢測體系的靈敏度和特異度。實時熒光雙重TaqMan PCR體系的靈敏度100倍高于普通雙重PCR檢測體系，并對50種腸道致病菌及院內(nèi)感染中常見的致病菌進行了檢測，未出現(xiàn)假陽性，特異性好。本研究建立的實時熒光雙重TaqMan PCR法為應(yīng)用于臨床標本的檢測提供了可靠的技術(shù)依據(jù)，可以作為阪崎腸桿菌一種常規(guī)的檢測方法，在臨床檢驗及檢疫中推廣使用。

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Novel duplex real－time TaqMan PCR assay for the detection ofEnterobactersakazakii

MENG Shuang，LI Juan，WANG Yan，BAI Xue－mei，YE Chang－yun

（StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl，NationalInstituteforCommunicableDisease ControlandPrevention，ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing102206，China）

To develop a sensitive and specific duplex real－time TaqMan polymerase chain reaction （ PCR）assay for the detection ofEnterobactersakazakii，2sets of primers and probes were designed based on the sequences of the internal transcribe spacer（ITS）and the outer member protein A （ompA）.High throughput real－time PCR system was used to evaluate the sensitivity of the assay，and the specificity was evaluated by 50other common enteropathogenic bacteria and some isolates causing nosocomial infection.The sensitivity of the duplex real－time PCR assay for testing of recombinant plasmids was 1×102copies per reaction，and the sensitivity for testing of theEnterobactersakazakiigenome DNA was 4×10－1pg per reaction.No specific amplifications were presented when the 50other common enter pathogenic bacteria and some isolates causing nosocomial infection were tested.Furthermore，the assay could be finished within 2hours.The duplex real－time TaqMan PCR assay developed in our study was sensitive，specific and rapid.It not only could be used for the detection ofEnterobactersakazakii，but also for the detection of the pathogenicity simultaneously.

Enterobactersakazakii；real－time TaqMan PCR；out member protein A；internal transcribe spacer

R378.2

A

1002－2694（2011）10－0857－04

＊國家科技重大專項資助（2008ZX10004－001，2009ZX10004－101）

葉長蕓，Email：yechangyun＠icdc.cn

中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，北京 102206

2011－04－11；

2011－06－18