膀胱癌中p53誘導基因3的表達及意義

劉海波，孔垂澤

（中國醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，沈陽 110001）

許多研究表明，p53蛋白表達是膀胱癌發生發展中的重要因子，p53行使其生物學效應主要通過p53蛋白與特異基因序列結合后，激活下游基因的表達來實現［1］。PIG3為p53誘導基因3（p53 inducible gene 3），是p53的下游基因之一，其基因全長7424 bp，定位于2p23.3，編碼分子量約35kD的蛋白質，其在膀胱癌發生發展中的作用目前尚不明確。本研究檢測40例膀胱癌標本及15例非腫瘤膀胱組織中PIG3蛋白表達情況，探討其在膀胱癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇中國醫科大學附屬第一醫院泌尿外科患膀胱癌而行膀胱全切或部分切除術的標本40例，及距腫瘤≥3 cm的膀胱組織標本15例為實驗對象。所有標本均得到患者授權。病例組40人，年齡42～87歲，平均年齡59歲，其中臨床分期T118例，T213例，T39例；術后病理分級G119例，G215例，G36例；復發性膀胱癌7例。對照組15例，年齡54～85歲，平均年齡63歲。手術切取的膀胱標本立即于無菌條件下放入消毒后的Eppendof管內，于液氮中30 min后放入-70℃深低溫冰箱凍存備用。

1.2 主要藥品、試劑及儀器

藥品及試劑：鼠抗人PIG3單克隆抗體購自美國Oncogene公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG購自美國Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自瑞典Pharmacia公司；硝酸纖維素膜購自美國Bio-rad公司。

實驗儀器：2K15C型低溫超速離心機為美國Sigma公司產品；Chemi Imager 5500電泳凝膠成像系統為美國Alpha公司產品；VC50T型超聲粉碎儀為美國Sonics&Materials公司產品；DIAX900型勻漿機為德國Heidolph公司產品；MultiphorⅡ型電泳儀為瑞典Pharmacia Biotech公司產品；Trans-Blot SD型半干轉膜儀為美國Bio-rad公司產品；UV300型紫外分光光度計為英國Unicam公司產品。

1.3 實驗方法

Western blot方法檢測PIG3蛋白表達。先提取各樣本組織的總蛋白，采用福林-酚法（lowry法）測定蛋白濃度后，煮沸變性5 min后備用。取40 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳（3%濃縮膠，5%分離膠），半干轉膜法轉膜。鼠抗人PIG3單克隆抗體（1∶200）孵育過夜，洗膜，1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG孵育2 h，之后顯色。Chemi Imager 5500電泳凝膠成像系統成像，應用Fluorchem v2.0凝膠成像分析軟件測定各條帶的積分吸光度值，計算各組樣本中PIG3蛋白含量的變化。同樣步驟加入鼠抗人β-actin單克隆抗體，檢測樣品中β-actin的蛋白表達作為內參照。

1.4 統計學處理

所得數據以±s表示，應用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，顯著性檢驗采用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

病例組及對照組均于同一位置（35 kDa）出現單一條帶（圖1）。對照組PIG3蛋白表達積分吸光度值為141.8±11.9；病例組的PIG3蛋白表達積分吸光度值隨病理分級升高而明顯減少，其中G1，G2，G3級PIG3蛋白表達積分吸光度值分別為96.3±8.7，30.7±3.6，19.9±2.9，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；隨臨床分期升高，PIG3蛋白含量亦明顯下降，其中T1與T2+T3組PIG3蛋白表達積分吸光度值分別為 75.4±12.5，32.1±5.4；組間比較差異有統計學意義（P<0.05）；復發性膀胱癌PIG3蛋白表達積分吸光度值為42.7±6.2，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。各組PIG3蛋白表達值見表1。

圖1 膀胱癌組織中表達PI G 3蛋白情況Fig.1 The level of PIG 3 protein in the bladders

表1 病例組及對照組中PI G 3蛋白積分吸光度值Tab.1 The level of PIG 3 protein in the cases

3 討論

野生型p53誘導凋亡的途徑之一，是通過PIG3的激活來促進活性氧簇的產生，進而誘導凋亡［2］。Contente等［3］研究發現：野生型p53直接而且特異地與PIG3中（TGYCC）15序列反應，PIG3通過野生型p53的過度表達而激活，這種PIG3激活與誘導凋亡之間的關聯提示PIG3的激活或相似調節有助于p53介導的細胞凋亡，在p53調節的生長抑制期間，PIG3水平顯著改變［4］。近來有研究表明PIG3在DNA損傷應答路徑中是一個關鍵因子［5］，在對乳腺癌和肺癌及白血病的研究中發現了PIG3表達水平的顯著變化［6～8］。突變型p53蛋白高表達多見于高分期及高級別腫瘤，與腫瘤復發，進展和整體生存時間縮短有關，而p53突變后不能激活PIG3啟動子，也不能誘導凋亡，這提示PIG3可能與惡性腫瘤的發生發展有關。

我們的研究結果顯示：各組病理分級及臨床分期的膀胱尿路上皮癌組織中PIG3蛋白表達積分吸光度值與對照組比較，均有明顯差別。隨著病理分級升高，PIG3蛋白表達值明顯降低，對照組與G1、G2、G3級比較，差異均有統計學意義（P<0.05），提示PIG3蛋白表達的多少與膀胱癌的惡性程度有著密切關聯；隨著臨床分期升高，PIG3蛋白表達呈下降趨勢，對照組與T1組及T2+T3組兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05），表明PIG3蛋白表達的多少與膀胱癌的浸潤及進展程度有著緊密聯系。以上結果也證實了PIG3蛋白在膀胱癌的發生、發展及預后判斷中有著重要作用。本研究發現：復發性膀胱癌患者的PIG3蛋白表達水平較G1級及T1組中PIG3蛋白表達值明顯減少，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。這提示PIG3蛋白表達降低與膀胱腫瘤復發或轉移的危險性增加有關，如果在早期和低級別膀胱腫瘤檢測到PIG3蛋白表達值減少，則可能提示該患者有早期轉移趨勢或高復發風險，應加強綜合治療和定期復診。

說明PIG3蛋白在膀胱癌的發生、發展中有著特定作用，其表達減少可能是膀胱癌進展及浸潤轉移的指征。我們認為：臨床上對PIG3蛋白的監測和研究將有助于膀胱癌的早期診斷及鑒別診斷，并能夠預測腫瘤的發展趨勢和轉移傾向，有望成為一種新的膀胱腫瘤標記物和新的臨床診斷指標。

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［3］Contente A，Dittmer A，Koch MC，et al.A polymorphic microsatellite that mediates induction of PIG3 by p53［J］.Nat Genet，2002，30（3）：315-320.

［4］Flatt PM，Polyak K，Tang LJ，et al.p53-dependent expression of PIG3 during proliferation genotoxic stress and reversible growth arrest［J］.Cancer Lett，2000，156（1）：63-72.

［5］Lee JH，Kang Y，Khare V，et al.The p53-inducible gene 3（PIG3）contributes to early cellular response to DNA damage［J］.Oncogene，2010，29（10）：1431-1450.

［6］Gorgoulis VG，Liloglou T，Sigala F，et al.Absence of association with cancer risk and low frequency of alterations at a p53 responsive PIG3 gene polymorphism in breast and lung carcinomas［J］.Mutat Res，2004，22，556（1-2）：143-150.

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