不同化療藥物介入干預(yù)環(huán)境下對(duì)肝癌細(xì)胞系的敏感性

朱林忠,朱 旭,楊仁杰,寧 濤

(1.北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院介入科;2.北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所,惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;北京 100142）

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma）是常見(jiàn)惡性腫瘤之一,我國(guó)是原發(fā)性肝癌的高發(fā)地區(qū),每年約有10余萬(wàn)人死于肝癌,外科手術(shù)切除率不足1/3,對(duì)于多數(shù)中晚期惡性腫瘤患者往往缺少有效的治療手段;全身化療、放療和局部消融等治療方法效果仍然不滿(mǎn)意,經(jīng)動(dòng)脈灌注化療栓塞術(shù)(transcatheter arterical chemoembolization,TACE）近年來(lái)以其可靠的療效及較低的并發(fā)癥逐漸成為中晚期原發(fā)性肝癌的首選治療方法[1,2];目前我院行介入治療時(shí)術(shù)中以栓塞為主,術(shù)后常規(guī)于腫瘤供血?jiǎng)用}留置導(dǎo)管6-48 h行持續(xù)動(dòng)脈化療;采用2-3種化療藥物序貫化療;該方法改變了藥代動(dòng)力學(xué),避免了首過(guò)效應(yīng),顯著增加了局部濃度;但是絕大多數(shù)的肝癌發(fā)生在已存在肝臟疾病(慢性乙型、丙型病毒性肝炎和/或酒精性肝硬化）的基礎(chǔ)上,肝功能已有損害,肝癌細(xì)胞暴露于高濃度的細(xì)胞毒性藥物的同時(shí),同時(shí)也能夠造成靶血管的損傷及鄰近正常肝組織的損傷;使肝星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、庫(kù)弗氏細(xì)胞的活性增加,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成、代謝異常,促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生;

為此介入學(xué)界已經(jīng)進(jìn)行了多種臨床實(shí)驗(yàn),證實(shí)小劑量動(dòng)脈持續(xù)化療同樣可以達(dá)到滿(mǎn)意的臨床效果,同時(shí)極大的保護(hù)了人體功能;但是給藥的劑量仍舊混亂,也沒(méi)有考慮每個(gè)患者的腫瘤負(fù)荷及分布;給藥的時(shí)間、方式也沒(méi)有定論;為此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)以便找出臨床最適合的藥物、濃度、作用時(shí)間以及藥物序貫,在減少毒副反應(yīng)的情況下保證療效;推進(jìn)精細(xì)化及規(guī)范化的腫瘤介入化療。

1 材料與方法

1.1 化療藥物濃度的設(shè)定

經(jīng)動(dòng)脈持續(xù)化療期間,局部血藥濃度極高,給藥期間,腫瘤組織中化療藥始終維持在高濃度狀態(tài);給藥結(jié)束后,該種藥物在腫瘤內(nèi)的濃度急劇下降;目前關(guān)于化療藥對(duì)腫瘤的作用的大部分研究采取的濃度多為靜脈化療模式下的血藥濃度,與動(dòng)脈化療實(shí)際能達(dá)到的濃度相差很大;各種高濃度的化療藥對(duì)腫瘤的作用也有研究,但是其作用時(shí)間臨床實(shí)踐難以達(dá)到;介入化療中如何確定局部血藥濃度目前仍沒(méi)有定論;即使按照統(tǒng)一方案給藥,每個(gè)患者的腫瘤供血量均不相同,局部血藥濃度差別也很大,造成局部用藥量不足/過(guò)剩;我們?cè)诮槿胫委熜g(shù)中測(cè)定了患者的肝癌供血?jiǎng)用}血流量,依據(jù)最終導(dǎo)管頭所處動(dòng)脈的不同,血流量波動(dòng)在0.5-6ml/s之間;根據(jù)這一結(jié)果及臨床藥物的常用劑量,我們計(jì)算出在各種情況下局部血藥濃度的范圍,在此范圍內(nèi)選取5個(gè)階梯血藥濃度,每一種藥物濃度分別與肝癌細(xì)胞系作用4個(gè)不同的時(shí)間段。

表1 各種藥物的藥物濃度梯度及持續(xù)作用時(shí)間

1.2 實(shí)驗(yàn)用試劑及儀器

1.2.1 試驗(yàn)用藥物 藥物的選擇:目前,多數(shù)臨床研究均集中于蒽環(huán)類(lèi)、5-Fu類(lèi)、鉑類(lèi)、喜樹(shù)堿類(lèi)、吉西他濱等藥物[3-6],以?shī)W沙利鉑、吉西他濱為基礎(chǔ)的新一代方案顯示了一定的療效優(yōu)勢(shì)和較好的安全性;為此,我們選擇了奧沙利鉑、順鉑、鹽酸表柔比星、鹽酸伊立替康、多西他賽、鹽酸吉西他濱、培美曲塞二鈉、5-氟尿嘧啶注射液作為觀察對(duì)象;分析方法采用常用的MTT法;各藥物來(lái)源如下:注射用鹽酸吉西他濱,0.2 g,哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)股份有限公司,100607;注射用培美曲塞二鈉,0.2 g,齊魯制藥有限公司,1010012DV;注射用奧沙利鉑,50 mg,賽諾菲,安萬(wàn)特,2010.03;注射用順鉑,10 mg齊魯制藥有限公司,111023CF;5-氟尿嘧啶注射液,0.25 g,天津金耀氨基酸有限公司,20101123;注射用鹽酸表柔比星,輝瑞制藥(無(wú)錫）有限公司,1007021;多西他賽注射液;江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,10112612;注射用鹽酸伊立替康40 mg江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司20100409;

1.2.2 實(shí)驗(yàn)用試劑及設(shè)備 96孔板:Costar 3599 Corning Incorporated,細(xì)胞系:人肝癌HepG-2細(xì)胞系,北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院遺傳室提供;培養(yǎng)液:DMEM+10%胎牛血清;MTT:MTT(四甲基氮唑藍(lán)）:Sigma公司產(chǎn)品108178;DMSO:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純 101201;潔凈臺(tái):Heal Force;孵育箱:SANYO MCO-15AC 37℃,5%CO2;顯微鏡:Olympus IX50倒置光顯微鏡;酶標(biāo)儀:BIO-RAD Model 680 microplate Reader;

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用人肝癌細(xì)胞系HepG-2,接種于100 ml玻璃培養(yǎng)瓶中,在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng),于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),每2-3天傳代一次。至細(xì)胞足夠數(shù)量,按照每孔2×103個(gè)細(xì)胞備用;

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG-2以2×103個(gè)/ml濃度100 μ l接種于96孔培養(yǎng)板上,加空白培養(yǎng)液90 μ l;DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后,其中化療藥與3種輔助用藥分別按照不同濃度各取10 μ l分別加入孔內(nèi),每一濃度加4個(gè)復(fù)孔,空白對(duì)照組加10 μ l培養(yǎng)液。藥物與細(xì)胞作用4h后,吸棄藥液及培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組和空白組均以培養(yǎng)液反復(fù)清洗,更換空白培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至72 h,然后統(tǒng)一進(jìn)行MTT檢測(cè),每孔加入MTT(5 g/L）10 μ l培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO）200 μ l,在 BIO-RAD Model 680 microplate Reader型酶標(biāo)儀上以570nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值(OD值,A值）,計(jì)算抑制率(%）=(1-A/A0）×100%。A:各藥物濃度組光吸收值(均值）,A0:未加藥物組(對(duì)照組）光吸收值(均值）。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)在人肝癌HepG-2細(xì)胞系中分別測(cè)定了9種化療藥物不同作用濃度和時(shí)間的作用特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)各種化療藥對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率存在較大差別,以?shī)W沙利鉑、表柔比星、多柔吡星脂質(zhì)體抑制率最高,5-Fu,順鉑、吉西他濱、培美曲塞二鈉、伊立替康次之,多西他賽抑制率較低;每一種藥物隨著濃度的提高,對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率增加,但是當(dāng)濃度增加到一定程度后,其抑制率基本保持不變;作用時(shí)間對(duì)抑制率也有很大影響,但是大多數(shù)化療藥達(dá)到一定時(shí)間后其效果增加也趨于平緩。

下列各圖為不同濃度化療藥物與肝癌細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果,橫軸為作用時(shí)間,縱軸為抑制率,每一條曲線代表一種濃度的化療藥在不同作用時(shí)間下對(duì)肝癌細(xì)胞系的抑制率。

圖1 不同濃度奧沙利鉑與HepG-2細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果

圖1中可以看出,奧沙利鉑在1 mg/L濃度下,其對(duì)腫瘤抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)增加,而當(dāng)濃度提高到5 mg/L和10 mg/L,作用2-4 h抑制率提高較快,4 h后則提高程度趨緩;當(dāng)濃度大于20 mg/L時(shí),作用2 h和4 h抑制率差別不大,隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制率未見(jiàn)提高,繼續(xù)提高至40 mg/L未見(jiàn)變化;說(shuō)明奧沙利鉑在較低濃度情況下其抑制率與時(shí)間呈正相關(guān),當(dāng)濃度提高時(shí),達(dá)到穩(wěn)定抑制率時(shí)間縮短,繼續(xù)提高濃度很快達(dá)到極限值。

圖2 不同濃度順鉑與HepG-2細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果

圖2中可以看出,各個(gè)濃度的順鉑在2 h和4 h內(nèi)抑制率差別不大,但是作用時(shí)間延長(zhǎng)到6 h后,1 mg/L、5 mg/L濃度抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而輕度增加,當(dāng)濃度提高到10 mg/L及更高濃度后,抑制率明顯增加,且差別不大,說(shuō)明順鉑作用需要較高濃度及較長(zhǎng)時(shí)間;6 h及10 mg/L濃度均達(dá)到較好的抑制效果。

圖3 不同濃度表柔比星與HepG-2細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果

表柔比星起效迅速,除1 mg/L濃度需要4 h達(dá)到最大抑制率外,其它濃度在2 h即達(dá)到較為穩(wěn)定的抑制率,且各濃度下抑制率相近;說(shuō)明該藥起效濃度低,需要維持的時(shí)間短。

圖4 不同濃度多西他賽與HepG-2細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果

多西他賽在0.5 mg/L的低濃度下,其抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)緩慢提高,到8 h時(shí)明顯提高,當(dāng)濃度大于1 mg/L后,隨時(shí)間延長(zhǎng)抑制率快速提高;繼續(xù)提高濃度抑制率提高緩慢;各個(gè)濃度到8 h時(shí)抑制率相近(圖3）。

圖5 不同濃度吉西他濱與HepG-2細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果

吉西他濱在5 mg/L和10 mg/L的較低濃度下,其抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而緩慢提高;當(dāng)濃度大于25 mg/L后,三個(gè)濃度下2-4 h抑制率增加,大于4 h后增加緩慢;各濃度之間無(wú)明顯差別(圖4）。

吉西他濱作用于S期,低濃度下表現(xiàn)為隨時(shí)間延長(zhǎng)抑制率增加,但是在高濃度下作用方式也類(lèi)似于CCNSA,較快達(dá)到最大抑制率,延長(zhǎng)時(shí)間、增加濃度無(wú)明顯變化。

圖6 不同濃度 CPT-11與HepG-2細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果

CPT-11在各個(gè)濃度下均表現(xiàn)為抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,8 h以?xún)?nèi)抑制率持續(xù)提高,但是當(dāng)濃度≥5 mg/L時(shí)抑制率不隨濃度增加而增加;單純表現(xiàn)為時(shí)間依賴(lài)特性(圖5）。

圖7 不同濃度培美曲塞二鈉與HepG-2細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果

培美曲塞二鈉在各個(gè)濃度下均表現(xiàn)為抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,各組濃度之間抑制率隨濃度增加輕度增加,更多表現(xiàn)為時(shí)間依賴(lài)特性(圖7）。

圖8 不同濃度5-Fu與HepG-2細(xì)胞系作用不同時(shí)間的結(jié)果

5-Fu隨著濃度增加,抑制率逐漸提高,大于10 mg/L后各濃度效果相近;24 h后抑制率增加緩慢(圖8）。

3 討論

經(jīng)動(dòng)脈持續(xù)灌注化療模式下,藥物經(jīng)動(dòng)脈泵持續(xù)、均勻的泵入,動(dòng)脈血流也同時(shí)以相對(duì)恒定的流量流入腫瘤組織內(nèi),使得局部血液中及腫瘤組織內(nèi)的藥物濃度在一特定時(shí)間段內(nèi)始終保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài);取得了全身化療無(wú)法取得的持續(xù)、穩(wěn)定的血藥濃度;在該時(shí)間段內(nèi),可以理解為腫瘤組織“浸泡”在恒定濃度的化療藥物中;且該藥物系直接接觸腫瘤,而沒(méi)有經(jīng)過(guò)人體代謝變化;為此我們完全可以在體外模擬出類(lèi)似的藥物環(huán)境。

目前我科在原發(fā)性肝癌介入治療中常規(guī)于栓塞治療后留置導(dǎo)管,于病房行持續(xù)動(dòng)脈灌注化療;較從前術(shù)中直接灌注,患者療效及耐受性均有改善;但是對(duì)于某一種化療藥的最佳作用時(shí)間及濃度仍缺乏基礎(chǔ)研究。

傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)涉及實(shí)驗(yàn)中所列項(xiàng)目,但是其濃度極少能達(dá)到臨床實(shí)踐中所能達(dá)到的濃度;高濃度下藥物的作用方面的資料較為零散;且其與作用時(shí)間的關(guān)聯(lián)缺乏報(bào)道;通過(guò)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn),對(duì)于周期依賴(lài)型藥物如5-Fu、CPT-11、多西他賽、培美曲塞二鈉隨著濃度提高,抑制率增加;但是更多的表現(xiàn)為隨時(shí)間延長(zhǎng),療效增加[7-9]。

CPT-11在人體中該藥經(jīng)過(guò)肝臟代謝、轉(zhuǎn)化,會(huì)成為細(xì)胞毒性更強(qiáng)的SN-38,我們實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有能模擬出該代謝途徑;但是通過(guò)觀察CPT-11本身對(duì)肝癌細(xì)胞系的作用,發(fā)現(xiàn)在各個(gè)濃度下均表現(xiàn)為抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,8h以?xún)?nèi)抑制率持續(xù)提高,但是當(dāng)濃度≥5 mg/L時(shí)抑制率不隨濃度增加而增加;單純表現(xiàn)為時(shí)間依賴(lài)特性;實(shí)驗(yàn)使用的是藥物原型,沒(méi)用使用其體內(nèi)代謝產(chǎn)物SN-38;抑制率偏低可能與此有關(guān)。

培美曲塞二鈉為葉酸代謝抑制劑,近年來(lái)也逐漸用于肝癌治療;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各個(gè)濃度下均表現(xiàn)為抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,不除外隨時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至8 h之外,抑制率會(huì)進(jìn)一步增加。

吉西他濱的細(xì)胞毒性表現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)增加,這符合其細(xì)胞周期依賴(lài)型藥物的特點(diǎn);但是實(shí)驗(yàn)還顯示,當(dāng)濃度≥25 mg/L與濃度≤10 mg/L效果差別明顯;這說(shuō)明細(xì)胞周期依賴(lài)型藥物同樣在高濃度下可以達(dá)到更好的殺傷作用;當(dāng)濃度≥25 mg/L時(shí),各濃度之間無(wú)明顯差別;

濃度依賴(lài)型藥物奧沙利鉑、順鉑、鹽酸表柔比星對(duì)于動(dòng)脈化療比較適合,雖然各自作用曲線不同,但是基本表現(xiàn)類(lèi)似,在較低濃度情況下,作用效果同時(shí)間成正相關(guān),在較高濃度下,則表現(xiàn)為起效時(shí)間縮短,延長(zhǎng)時(shí)間療效增加不明顯;在高濃度情況下,則更多的表現(xiàn)為與濃度相關(guān),延長(zhǎng)時(shí)間并不能增加療效[10]。

藥物濃度和時(shí)間的關(guān)系:在低濃度情況下,藥物對(duì)腫瘤的抑制率歲時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加;但是隨著濃度的提高,其毒性作用很快即能達(dá)到最大值,繼續(xù)延長(zhǎng)作用時(shí)間意義不大;從曲線中還可以看出,大多數(shù)藥物是有“飽和濃度”的,當(dāng)濃度提高到一定程度時(shí),繼續(xù)增加濃度,抑制率沒(méi)有明顯提高;每一種藥物都有各自最佳濃度—時(shí)間組合,在此濃度/時(shí)間之上則存在飽和現(xiàn)象;這提示我們用藥時(shí)要把握合適的劑量及時(shí)間,在保證足夠的細(xì)胞毒性前提下,減少藥物不良反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,每一種藥物都有其適合的作用濃度及作用時(shí)間;臨床上完全可以根據(jù)每一個(gè)患者的具體情況設(shè)計(jì)用藥;在保證足夠濃度的情況下,沒(méi)有必要無(wú)限制的延長(zhǎng)作用時(shí)間,這樣只能增加用藥總量,加重肝臟損傷及全身毒性。

實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了各種藥物在肝癌細(xì)胞系中的作用,對(duì)于其它肝癌細(xì)胞系未作進(jìn)一步檢測(cè);細(xì)胞學(xué)代謝環(huán)境與生物體內(nèi)環(huán)境的差別以及人體腫瘤的基因型的差異,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生物體內(nèi)結(jié)果是否相符還需要進(jìn)一步驗(yàn)證;對(duì)于濃度依賴(lài)性藥物,最低濃度與下一濃度之間相差5倍,需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)細(xì)化濃度梯度。

[1]Ganeshan A,Upponi S,Hon LQ,Warakaulle D,Uberoi R.Hepatic arterial infusion of chemotherapy:the role of diagnostic and interventional radiology[J].Ann Oncol,2008,19:847.

[2]Iguchi T,Arai Y,Inaba Y,Yamaura H,Sato Y,Miyazaki M,Shimamoto H.Hepatic arterial infusion chemotherapy through a port-catheter system as preoperative initial therapy in patients with advanced liver dysfunction due to synchronous and unresectable liver metastases from colorectal cancer[J[.Cardiovasc Intervent Radiol,2008,31:86.

[3]楊朝旭,秦叔逵.奧沙利鉑治療原發(fā)性肝癌的臨床研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2010,(09）.

[4]華燕艷,李 杰,楊章庚,王瓊瑤,王衛(wèi)國(guó),謝其根.含奧沙利鉑方案TACE治療原發(fā)性肝癌的臨床觀察[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2011,(05）.

[5]QIAN J.The progress of clinical research on systemic chemotherapy for primary liver cancer[J].Medical Imformation,2008,21(5）:758.

[6]彭小東,肖恭衛(wèi),元建華.低劑量持續(xù)靜脈滴注吉西他濱一線治療晚期肝細(xì)胞癌的臨床研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,21(8）:946.

[7]Cohn AL,Myers JW,Mamus S,et al.A phase II study of pemetrexed in patients with advanced HepGGatocellular carcinoma[J].Invest New Drugs,2008,26(4）:381.

[8]Ohtsubo K,Watanabe H,Tsuchiyama T,et al.Advanced HepGGatocellular carcinoma treated effectively with irinotecan via hepatic arterial infusion followed by proton beam therapy[J].J Infect Chemother,2009,15(5）:316.

[9]Takahata T,Ookawa K,Suto K,et al.Chemosensitivity determinants of irinotecan hydrochloride inHepGGatocellular carcinoma cell lines[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2008 Apr;102(4）:399.

[10]Rathore R,Safran H,Soares G,et al.Phase I study of hepatic arterial infusion of oxaliplatin in advanced hepatocellular cancer:a brown university oncology group study[J].Am J Clin Oncol,2010,33(1）:43.