大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定

李樹(shù)貴,于海翔,楊 光*

(1.柳河縣醫(yī)院外四科,吉林柳河 135300;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs）是一種來(lái)源于骨髓的成體干細(xì)胞,具有自我更新和多向分化能力。它不僅能分化為中胚層的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等,近年的研究還發(fā)現(xiàn)可跨胚層分化為肝細(xì)胞[1]、神經(jīng)細(xì)胞[2、3]、心肌細(xì)胞[4],因而引起了更廣泛的關(guān)注,已成為組織工程、基因治療和再生醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)。在體外成功分離培養(yǎng)MSCs是研究其分化機(jī)制、基因調(diào)控、乃至實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的前提。我們采用貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs）,觀察其生物學(xué)特性和多向分化能力,并給予鑒定,為下一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

選取出生5-7天的清潔級(jí)Wistar大鼠(體重6.0-8.0 g）,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。低糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司）、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(GIBCO公司）、胰蛋白酶(Sigma公司）。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取

將新生大鼠頸椎脫臼處死后,放入75%的乙醇內(nèi)浸泡5 min。無(wú)菌條件下取出雙側(cè)股骨,去除附帶組織,兩端剪斷暴露骨髓腔。以1 ml注射器吸取低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)沖洗,至骨質(zhì)發(fā)白為止,將所收集的細(xì)胞懸液用200目濾網(wǎng)過(guò)濾,制備成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1.0×106/ml接種到含20%胎牛血清的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和擴(kuò)增

培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。5天后首次半量換液,以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化,每隔3-4天更換全部培養(yǎng)液1次。在貼壁細(xì)胞80%-90%融合后,吸盡培養(yǎng)液,以低糖DMEM培養(yǎng)液洗1遍后,加入適量0.25%胰蛋白酶,放入培養(yǎng)箱內(nèi)消化30 s,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞成片收縮,棄掉胰酶,加入胎牛血清終止消化,低糖DMEM培養(yǎng)液洗1遍,加入含20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液,彎頭吸管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液,以1∶2傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期

取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)至少1×106個(gè),消化離心收集后,加入到70%冰乙醇中20 min,1,000 rpm離心5 min,棄上清,PBS重懸細(xì)胞,200目濾網(wǎng)過(guò)濾,PBS洗2遍,以0.3 ml細(xì)胞周期染色液重懸細(xì)胞,4℃放置30 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)

第3代細(xì)胞傳代時(shí),在培養(yǎng)瓶中預(yù)先放置玻片,觀察細(xì)胞70%-80%貼壁后,加入成骨誘導(dǎo)劑,各成分使用終濃度:地塞米松0.1 μ M、β-磷酸甘油鈉10 mM、抗壞血酸磷酸鹽50 uM。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的高糖D MEM細(xì)胞培養(yǎng)液,繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),相差顯微鏡定期觀察,每3天半量換液,誘導(dǎo)2周,進(jìn)行堿性磷酸酶(AKP）染色。

1.6 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)

第3代細(xì)胞傳代時(shí),在培養(yǎng)瓶中預(yù)先放置玻片,觀察細(xì)胞60%-70%貼壁后,更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基,為含20%馬血清的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。相差顯微鏡定期觀察,3天半量換液,共誘導(dǎo)2周,進(jìn)行油紅O染色。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

相差顯微鏡下觀察,剛接種時(shí)為懸浮于培養(yǎng)液中的大小不等圓形細(xì)胞,48 h后可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞貼壁,為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,以后貼壁細(xì)胞逐漸增多,約在9-12天80%-90%長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底,融合成單層,此時(shí)傳代,傳代后的 BMSCs形態(tài)更加均一,排列更加有序,呈魚(yú)群樣、漩渦狀或網(wǎng)狀排列,3-4天左右即可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底。傳至第6代,形態(tài)無(wú)明顯變化,未出現(xiàn)衰老征象。

2.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期結(jié)果

通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定BMSCs細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)平均11.41%的細(xì)胞處于S+G2+M期,88.59%處于G0/G1期(圖1）,提示BMSCs絕大多數(shù)處于靜止期,而少數(shù)處于S+G2+M期,即增殖期。

2.3 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果

誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞變?yōu)槎嘟切巍⒉灰?guī)則形,胞漿中含有較多顆粒,部分細(xì)胞聚集成集落,堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性(圖2）。

2.4 向成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果

誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后,鏡下可見(jiàn)小部分細(xì)胞內(nèi)有少量細(xì)小脂滴,以后內(nèi)含脂滴的細(xì)胞逐漸增多,并且脂滴增大,融合成團(tuán),細(xì)胞也由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形、橢圓形。誘導(dǎo)2周時(shí)油紅O染色,Giemsa復(fù)染,細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大小不等圓形脂滴空泡,部分被染成特異性橘紅色(圖3）。未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞胞漿中無(wú)脂滴,油紅染色陰性。

圖1 第3代BMSCs培養(yǎng)3天

圖2 BMSCs成骨誘導(dǎo)堿性磷酸酶染色(×200）胞漿中可見(jiàn)黑色顆粒沉著,呈陽(yáng)性反應(yīng)。

圖3 BMSCs成脂誘導(dǎo)油紅O染色、Gimesa復(fù)染(×400）胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂肪空泡,被油紅染成橘紅色。

3 討論

人們已經(jīng)從骨、脂肪、臍血等多種組織中成功分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞[5-8],但目前從骨髓中分離培養(yǎng)仍為獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的主要方法。由于間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中含量極少,貼壁生長(zhǎng)干細(xì)胞僅占人骨髓中有核細(xì)胞的0.001%[5],故需特定的分離培養(yǎng)方法。1976年由Friedenstein等[8]首先利用貼壁法從小鼠的骨髓中分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞,他將全部骨髓細(xì)胞置于塑料培養(yǎng)皿中,根據(jù)干細(xì)胞在特定培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)的特性,通過(guò)換液去除不貼壁的其它雜質(zhì)細(xì)胞后,獲得呈梭形的貼壁干細(xì)胞。之后人們采用密度梯度離心法和貼壁法相結(jié)合,即根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分密度的不同,先離心分離單個(gè)核細(xì)胞后再接種,之后通過(guò)貼壁法進(jìn)一步純化。另外還有免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀篩選法[9,10],但成本較高、技術(shù)難度大,加之骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞尚未發(fā)現(xiàn)其特有的表面標(biāo)志,故應(yīng)用較少,目前常用方法仍為貼壁法和密度梯度離心法。

雖然密度梯度離心法可在原代獲得較純化的細(xì)胞,但BMSCs的分離密度尚未明確,且離心后仍需用貼壁法進(jìn)一步純化,操作步驟復(fù)雜,離心過(guò)程中不可避免的造成細(xì)胞損失,故其優(yōu)勢(shì)并不明顯。本實(shí)驗(yàn)采用貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,利用干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特性,換液去除懸浮的血細(xì)胞,并隨著細(xì)胞傳代,去除其它可貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)過(guò)傳代后細(xì)胞形態(tài)趨向一致,為成纖維細(xì)胞樣,從而獲得純化的細(xì)胞,具有操作簡(jiǎn)便,費(fèi)用低廉,成功率高的優(yōu)點(diǎn)。有研究表明細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增1、2代后純度可達(dá) 95%和98%[5]。在先前的預(yù)實(shí)驗(yàn),小鼠BMSCs分離培養(yǎng)的過(guò)程中[11],我們發(fā)現(xiàn)隨著取材鼠齡增大,細(xì)胞活性和增殖能力下降,故本實(shí)驗(yàn)選擇出生1周內(nèi)的新生大鼠取材,所獲得細(xì)胞活性好,增殖能力強(qiáng)。傳至第6代,細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化,未出現(xiàn)衰老征象,適于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。

在使用的血清濃度問(wèn)題上,國(guó)內(nèi)外不同的實(shí)驗(yàn)室所用并不一致,報(bào)道多在5%-20%之間[12-14]。雖然也有人對(duì)比過(guò)不同濃度血清對(duì)所培養(yǎng)BMSCs的影響,但因?qū)嶒?yàn)條件和所使用的血清來(lái)源不同,得出的結(jié)論也并不一致[15-17],故尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)使用濃度20%的國(guó)產(chǎn)胎牛血清,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,并未過(guò)早出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯和分化的現(xiàn)象。對(duì)于細(xì)胞接種密度,如果密度過(guò)小,會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,甚至死亡;而密度過(guò)大,細(xì)胞間產(chǎn)生接觸抑制,也將致使生長(zhǎng)緩慢,同時(shí)由于細(xì)胞代謝旺盛,導(dǎo)致?lián)Q液頻繁,加大了工作量,增加了污染機(jī)率。經(jīng)過(guò)摸索,我們認(rèn)為原代接種時(shí)細(xì)胞密度4.0×105/cm2左右比較適合。

在相差顯微鏡下觀察,剛接種時(shí)為大小不等的多種細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中,BMSCs逐漸貼壁生長(zhǎng),并拉長(zhǎng)為成纖維細(xì)胞樣,經(jīng)換液和傳代去除雜質(zhì)細(xì)胞后,所獲細(xì)胞形態(tài)均一,排列有序,培養(yǎng)3～4天即可傳代擴(kuò)增,表現(xiàn)了較強(qiáng)的增殖能力。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了第3代BMSCs的細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)絕大部分細(xì)胞處于靜止期G1/G0期,少部分處于S+G2+M期,這和大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[18],說(shuō)明絕大部分細(xì)胞處于靜止態(tài),但保留自我更新和增殖能力,少部分處于功能態(tài),符合干細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。具有多向分化能力是干細(xì)胞的另一主要特性,本實(shí)驗(yàn)對(duì)所培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化,鑒定結(jié)果顯示實(shí)現(xiàn)了向成骨和脂肪細(xì)胞分化。而未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞堿性磷酸酶染色為陰性,排除了所獲細(xì)胞為成骨細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。

BMSCs的表面抗原表型并不是單一的,而是兼有間充質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的特點(diǎn),可表達(dá)細(xì)胞粘附分子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分等多種抗原。目前尚未發(fā)現(xiàn)可作為BMSCs標(biāo)志物的特異性抗原[19,20],故無(wú)法直接鑒定得到的BMSCs。一般的鑒定方法都是通過(guò)培養(yǎng)傳代后,對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞根據(jù)干細(xì)胞的生物學(xué)特性逆推,從而得知是否是BMSCs。本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞由骨髓取材,在特定的培養(yǎng)基中呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng),形態(tài)結(jié)構(gòu)具有幼稚細(xì)胞的特征,并可分化為成骨和脂肪兩種不同的終末細(xì)胞,故可認(rèn)為是骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。

綜上所述,我們?cè)隗w外成功的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增了大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞,熟悉了其一般生物學(xué)特性,并通過(guò)檢測(cè)其多向分化能力給予鑒定,為下一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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