同型半胱氨酸對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

邢 躍,王紅月,竇海川,崔明姬*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科,吉林長(zhǎng)春 130033;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春 130021）

高同型半胱氨酸血癥是動(dòng)脈粥樣硬化(AS）性血管疾病形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,但其機(jī)制至今不完全清楚。起初,人們大都致力研究于同型半胱氨酸(Hcy）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用,發(fā)現(xiàn)Hcy可損害內(nèi)皮細(xì)胞,影響其舒張功能,近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的Hcy能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC）的增殖,而VSMC的異常增殖是AS性血管性疾病發(fā)生過(guò)程中重要的病理現(xiàn)象[1]。然而,VSMC的增殖又并存著VSMC凋亡,VSMC增殖與凋亡是維持血管壁細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定的一對(duì)基本因素,其調(diào)節(jié)失控是AS的主要原因之一。本研究觀察Hcy對(duì)體外培養(yǎng)的人VSMC凋亡和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討Hcy導(dǎo)致AS的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM、胎牛血清、新生牛血清(Gibco公司提供）、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma公司）、醫(yī)用胰島素、EDTA、青霉素 、鏈霉素、D-Hank′s 液、PBS 液、DBA液,兔抗人α-actin抗體(武漢博士德公司提供）、同型半胱氨酸(Sigma公司提供）、PI/Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒(Sigma公司提供）、RNA提取試劑TR IZOL(Invitrogen）、dNTP、Taq酶(美國(guó)Promega公司提供）,PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司提供）,引物賽百盛公司合成。全封閉PCR紫外透射儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司）紫外與可見(jiàn)光分光分析儀(HITACHI u-2000型,日本）FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司）。

1.2 人VSMC的體外培養(yǎng)、鑒定及實(shí)驗(yàn)分組

取無(wú)菌新鮮臍帶,采用貼塊法培養(yǎng)人VSMC,細(xì)胞鑒定用第5代細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),行α-actin免疫組化檢測(cè)。取5-10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

將人VSMC細(xì)胞分別置于Hcy終濃度為0 μ mol/L 、150 μ mol/L、250 μ mol/L 、550 μ mol/L、1 000 μ mol/L,1 550 μ mol/L,即 6個(gè)濃度組 ,每個(gè)濃度組設(shè)6個(gè)培養(yǎng)孔,培養(yǎng)24 h,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(磷酸鹽緩沖液組）和陽(yáng)性對(duì)照組(脂多糖組）。還有Hcy終濃度為1 000 μ mol/L的培養(yǎng)液中分別孵育0 h、6 h、12 h、24 h、48 h,即5個(gè)時(shí)間組,每個(gè)時(shí)間組設(shè)6個(gè)培養(yǎng)孔。

1.3 VSMC細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

凋亡檢測(cè)采用Annexin V-FITC/PI標(biāo)記試劑盒檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM）分析。結(jié)果判斷:凋亡及死亡的細(xì)胞均表現(xiàn)膜磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS）外翻以致Annexin V染色陽(yáng)性,而活細(xì)胞Annexin V染色陰性,但細(xì)胞凋亡早期仍保持細(xì)胞膜的完整性,因此,同活細(xì)胞一樣,PI不能透過(guò)細(xì)胞膜而表現(xiàn)為PI染色陰性,而死亡細(xì)胞則為PI染色陽(yáng)性。即左下象限PI-Annexin V-為活細(xì)胞,右下象限PI-/Ann-exin V+為凋亡細(xì)胞,右上象限PI+/Annexin V+為死亡細(xì)胞,左上象限PI+Annexin V-為機(jī)械損傷的細(xì)胞。

1.4 RT-PCR法檢測(cè) Bcl-2、Bax及 Caspase-3mRNA的表達(dá)

用TR IZOL總RNA抽提試劑盒抽提各組細(xì)胞的總RNA各5 μ g,按 RT-PCR試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,取產(chǎn)物2 μ l進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Bcl-2的引物 :正義鏈 :5′-CGA CGA CTT CTC CCG CCG CTA CCG C-3′,反義鏈 :5′-CCG CAT GCT GGG GCC GTA CAT TTC C-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為318 bp;Bax的引物:正義鏈:5′-TCC ACC AAG AAG CTG AGC GAG-3′,反義鏈:5′-GTC CAG GCC CAT GAT GGT TCT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為257bp;Caspase-3 的引物:正義鏈 :5′-TGG AAT GTC ATC TCG CTCTG-3′,反義鏈 :5′-GTC CCA CTG TCT GTC TCAAT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為 357 bp;β-actin 引物:正義鏈:5′-GTG GGG CGC CCC AGC ACC A-3′,反義鏈:5′-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為548 bp。反應(yīng)后取終產(chǎn)物5 μ l在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分析,至外線照像,用圖像分析系統(tǒng)測(cè)出目的基因及β-actin的積分吸光度(A）值,計(jì)算目的基因與β-actin擴(kuò)增條帶吸光度(A）比值作為目的基因mRNA的表達(dá)強(qiáng)度。每組檢測(cè)6次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Hcy對(duì)人VSMC凋亡的影響

人VSMC在6個(gè)不同濃度Hcy的培養(yǎng)液中孵育24h后,細(xì)胞凋亡率分別為(2.98±0.23）%、(3.11±0.89）%、(8.45±2.41）%(P均 ＜0.05 vs 0、150μ mol/L）、(14.37±4.71）%(P均 ＜0.05 vs 0、150 μ mol/L 、250 μ mol/L）、(15.75 ±4.56）%、(P均 ＜0.05 vs 0 、150 μ mol/L 、250 μ mol/L）、(13.56 ±3.02）%(P均 ＜0.05 vs 0 、150 μ mol/L、250 μ mol/L）,VSMC 的凋亡率隨著Hcy濃度的增加明顯升高,至1 000 μ mol/L達(dá)到峰值,而后降低,表明在1 000 μ mol/L濃度范圍內(nèi),Hcy呈劑量依賴性誘導(dǎo)人VSMC細(xì)胞凋亡。

2.2 同一濃度不同時(shí)間Hcy對(duì)人VSMC凋亡的影響

在濃度為1 000 μ mol/L Hcy的培養(yǎng)液中孵育0 h 、6 h、12 h、24 h、48 h 后的細(xì)胞凋亡率分別為(2.53±0.47）%、(2.67±1.25）%、(7.68±3.04）%(P均＜0.05vs 0 h、6 h）、(14.37±4.71）%(P均＜0.05 vs 0 h 、6 h、12 h）、(13.76±4.34）%(P均＜0.05 vs 0 h、6 h、12 h）,6 h細(xì)胞凋亡無(wú)顯升高,但隨后細(xì)胞凋亡率逐漸升高,至24 h達(dá)到峰值,而后降低,表明在作用早期,Hcy無(wú)明顯的誘導(dǎo)VSMC凋亡作用,但在24 h內(nèi)Hcy呈時(shí)間依賴性誘導(dǎo)人VSMC細(xì)胞凋亡。

2.3 Hcy對(duì)人VSMC Bcl-2、Bax及Caspase-3mRNA表達(dá)的影響

VSMC在6個(gè)不同濃度Hcy的培養(yǎng)液中孵育24 h后 Bax mRNA的表達(dá)量除了Hcy 150 μ mol/L組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,余四組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）,在Hcy 1 000 μ mol/L組時(shí)達(dá)到峰值,而后降低;Bcl-2 mRNA表達(dá)量在1 000 μ mol/L濃度范圍內(nèi),隨著Hcy濃度的增加Bcl-2 mRNA表達(dá)量有下降趨勢(shì),但各組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）;Caspase-3 mRNA表達(dá)量除了Hcy 150 μ mol/L組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,余四組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）,在1 000 μ mol/L濃度范圍內(nèi),隨著Hcy濃度的增加Caspase-3mRNA的表達(dá)量逐漸上升,表達(dá)在 1 000 μ mol/L Hcy達(dá)到峰值,而后降低。(見(jiàn)圖 1、2、3 和表 1）。

圖1 人VSMC Bax mRNA RT-PCR電泳圖

圖2 人VSMC Bcl-2 mRNA RT-PCR電泳圖

圖3 人VSMC Caspase-3 mRNA RT-PCR電泳圖

3 討論

AS是危害人類健康的最重要的心血管疾病。AS是指發(fā)生在大型或中型彈性動(dòng)脈、肌型動(dòng)脈壁內(nèi)膜及內(nèi)膜下,以脂質(zhì)沉著,并伴有中層VSMC向內(nèi)膜移行、增殖為特征,內(nèi)膜增厚發(fā)展而形成的粥樣病灶或纖維脂質(zhì)斑塊。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種生理性死亡模式,通過(guò)這一模式機(jī)體控制組織中細(xì)胞數(shù)目,清除無(wú)用的、有害的及異常的細(xì)胞,從而維持機(jī)體自身穩(wěn)定。最近的許多研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞凋亡是AS病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。VSMC是AS斑塊主要的細(xì)胞成分,VSMC的過(guò)度增殖與過(guò)度凋亡構(gòu)成了AS斑塊形成的主要病理基礎(chǔ)。chen等[3]研究證實(shí)晚期粥樣斑塊內(nèi)VSMC較正常血管壁的VSMC增殖減少且更易凋亡。

表1 不同濃度組 VSMC Bax、Bcl-2mRNA和Caspase-3mRNA表達(dá)量(±s）

表1 不同濃度組 VSMC Bax、Bcl-2mRNA和Caspase-3mRNA表達(dá)量(±s）

與對(duì)照組比較:#P＜0.05

Hcy(μ mol/L） Bax mRNA Bcl-2 mRNA Bax/Bcl-2 的比值 Caspase-3mRNA 0.86±0.01 1.38±0.04 0.63±0.05 0.90±0.01 150 0.92±0.03 1.32±0.03 0.75±0.04 0.99±0.03 250 1.51±0.02# 1.28±0.02 1.31±0.06# 1.78±0.02#550 1.82±0.03# 1.21±0.02 1.63±0.04# 2.02±0.03#1000 1.91±0.02# 1.09±0.02 1.84±0.05# 2.93±0.02#1550 1.70±0.02# 1.20±0.02 1.61±0.05# 2.08±0.02#0

Hcy是一種含硫氨基酸,體內(nèi)蛋氨酸分解過(guò)程中產(chǎn)生的一個(gè)重要中間產(chǎn)物。高Hcy血癥是AS和血栓形成等心腦血管疾病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,但其機(jī)制尚未完全闡明。Buemi等[4]的研究表明,人股動(dòng)脈VSMC與10-20mmol/L Hcy孵育24 h后,細(xì)胞凋亡數(shù)目呈濃度依賴性增加。本研究的結(jié)果顯示,人臍動(dòng)脈VSMC 在150 μ mol/L Hcy孵育24 h后,細(xì)胞凋亡無(wú)明顯升高,但是隨著濃度的增加,細(xì)胞凋亡明顯升高,至1 000 μ mol/L達(dá)到峰值,而后降低,表明在1 000 μ mol/L濃度范圍內(nèi),Hcy呈劑量依賴性誘導(dǎo)人VSMC細(xì)胞凋亡;550 μ mol/L Hcy在作用早期6h對(duì)人臍動(dòng)脈VSMC凋亡無(wú)明顯升高,但隨后細(xì)胞凋亡率逐漸升高,至24 h達(dá)到峰值,表明在24 h內(nèi)Hcy呈時(shí)間依賴性誘導(dǎo)人VSMC細(xì)胞凋亡,提示高Hcy血癥導(dǎo)致AS作用可能與其誘導(dǎo)VSMC調(diào)亡有關(guān)。

Hcy誘導(dǎo)VSMC調(diào)亡的機(jī)制目前尚不清楚。細(xì)胞凋亡有多條死亡信號(hào)通路介導(dǎo),其中Bcl-2家族和Caspase家族目前被認(rèn)為是在凋亡的信號(hào)傳遞和調(diào)節(jié)方面具有關(guān)鍵性的作用。Bcl-2家族蛋白又分為兩類,即凋亡抑制蛋白(包括 Bcl-2、Bcl-xl、bag、Bcl-w等）和凋亡誘導(dǎo)蛋白(Bax、Bcl-xs、Bak 、Bad、Bid 等）,這兩類蛋白的比例決定了細(xì)胞在收到信號(hào)時(shí)是否發(fā)生凋亡。Caspase是一組天門冬氨基酸特異性的半胱氨酸蛋白酶,Caspase在凋亡信號(hào)作用下發(fā)生逐級(jí)水解活化,最后裂解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,使細(xì)胞分解引起凋亡,故Caspase的活化是導(dǎo)致凋亡的中心環(huán)節(jié)。Caspase家族有多個(gè)成員,已有14種Caspase被克隆,其中Caspase-2、8、9可介導(dǎo)相應(yīng)凋亡信號(hào),啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡,稱為啟動(dòng)性Caspase;Caspase-3、6、7通過(guò)裂解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,使細(xì)胞解體,稱為效應(yīng)性Caspase。盡管在不同細(xì)胞或同一細(xì)胞受不同刺激誘發(fā)凋亡過(guò)程中激活的Caspase不盡相同。Caspase-3是直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡最重要的蛋白酶之一[5],Kim等[6]等研究證實(shí)了小鼠VSMC的凋亡是由Caspase-3介導(dǎo)的一系列蛋白酶激活而造成的。本研究的結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的人臍動(dòng)脈VSMC在不同濃度Hcy的培養(yǎng)液中孵育24h后的Bax mRNA表達(dá)量在一定濃度范圍內(nèi),隨濃度增加逐漸升高,而B(niǎo)cl-2 mRNA的表達(dá)與濃度無(wú)關(guān);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Hcy在一定濃度范圍內(nèi),可上調(diào)Bax/Bcl-2的比值,并呈濃度依賴性。Caspase-3mRNA的表達(dá)在Hcy濃度1000μ mol/L時(shí)達(dá)峰值,在此濃度范圍內(nèi)Caspase-3mRNA的表達(dá)呈劑量依賴性上升。本研究結(jié)果,可推測(cè),VSMC在Hcy濃度1 000 μ mol/L范圍內(nèi)的作用下,Bax水平升高,而B(niǎo)cl-2水平下降,導(dǎo)致Bax與Bcl-2比例失調(diào),Bax形成同源二聚體,進(jìn)而線粒體通透性增加,跨膜電位下降,線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放,使Caspase-9激活,并進(jìn)一步激活Caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

就高Hcy血癥而言,雖然研究表明其可能通過(guò)誘導(dǎo)VSMC的凋亡而致AS,但是目前其機(jī)制尚不清楚,對(duì)于凋亡發(fā)生、調(diào)節(jié)機(jī)制的進(jìn)一步理解,將推動(dòng)高Hcy血癥與AS性血管疾病關(guān)系等方面的研究,如何調(diào)控高Hcy血癥對(duì)VSMC凋亡尚有待于進(jìn)一步研究。

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[2]方麗娟,劉乃豐.細(xì)胞凋亡與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版）,2010,29(1）:107.

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