蛋白酶抑制劑MG132在聯(lián)合NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化過(guò)程中的作用及機(jī)制

王曉明,盧 偉,丁 軍

(臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院解剖與組織胚胎學(xué)教研室,浙江臺(tái)州318000;吉林大學(xué)第三臨床醫(yī)院放射科,吉林長(zhǎng)春 130033）

神經(jīng)細(xì)胞突起的形成是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個(gè)重要過(guò)程,這個(gè)過(guò)程主要受神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic cytokine）,如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF）的調(diào)控。NGF可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)出突起,其機(jī)制是通過(guò)活化其特異性受體,酪氨酸激酶受體A(tyrosine kinase receptor,TrkA）,使其磷酸化,從而激活了胞內(nèi)的受TrkA調(diào)控的一系列的胞內(nèi)信號(hào)通路完成的[1-3],如胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase/mitogen activated protein kinase,ERK/MAPK）通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K/AKT）途徑[4,5],且誘導(dǎo)與TrkA的磷酸化時(shí)效有關(guān)[6,7]。

泛素(ubiquitin,UB）是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的小蛋白。它的主要功能是標(biāo)記需要分解掉的蛋白質(zhì),當(dāng)附有泛素的蛋白質(zhì)接觸到蛋白酶時(shí),蛋白酶就會(huì)將該蛋白質(zhì)水解。泛素也可以標(biāo)記跨膜蛋白,如受體,將其從細(xì)胞膜上除去。最新研究報(bào)道稱,TrkA受體在與NGF結(jié)合的過(guò)程,可以被NGF泛素化(ubiquitinated）,而且泛素化過(guò)程可以調(diào)節(jié)活化TrkA受體胞外域由細(xì)胞的表面轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)(簡(jiǎn)稱內(nèi)化）以及TrkA介導(dǎo)的信號(hào)通路[8-10]。外有報(bào)道稱NGF在誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞突起產(chǎn)生的過(guò)程中伴有內(nèi)源性泛素和泛素化蛋白(ubiquitinated proteins）水平的升高[11]。目前雖已證實(shí)蛋白酶抑制劑可以誘導(dǎo)神細(xì)胞產(chǎn)生突起以及增強(qiáng)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的作用[12-14],具體機(jī)制仍未明晰的,而且作用效果較弱[15],且有報(bào)道稱高濃蛋白酶抑制劑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有細(xì)胞毒效應(yīng)[16]。在本實(shí)驗(yàn)中我們選用了一種常見(jiàn)的蛋白酶抑制劑,MG132,探討蛋白酶抑制MG132在聯(lián)合NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化中的作用,并分析其誘導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

蛋白酶抑制劑MG132,購(gòu)自Sigma公司,美國(guó);NGF(商品號(hào)ab105059）及抗體:抗TrkA胞外域抗體(商品號(hào)ab8871）,抗泛素抗體(商品號(hào)ab8134）,抗Phospho-TrkAY490抗體(商品號(hào)ab1445）,抗TrkA抗體(商品號(hào) ab76291）,FITC熒光標(biāo)記物(商品號(hào)ab8030）,均購(gòu)自 Abcam生物試劑公司,上海。DMEM、馬血清(商品號(hào)S9050）、牛血清白蛋白(BSA,商號(hào)號(hào)A8010）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司,上海。

1.2 PC12細(xì)胞的獲得、培養(yǎng)及分組

PC12細(xì)胞(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所）,接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),培養(yǎng)基為高糖Dulbecco的改良Eagle的培養(yǎng)基(DMEM,Gibco,上海索萊寶生物科技有限公司）,添加10%馬血清,5%BSA,37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12細(xì)胞,胰酶消化、離心,調(diào)細(xì)胞濃度1×105個(gè)/ml,并接種到多聚賴氨酸包被6孔培養(yǎng)板中。

實(shí)驗(yàn)分2組:Group I:NGF單獨(dú)誘導(dǎo)組,培養(yǎng)體系內(nèi)加終濃度為50 ng/ml的NGF;Group II:NGF與MG132聯(lián)合誘導(dǎo)組,培養(yǎng)體系內(nèi)加50 ng/ml的NGF、0.5-20 μ mol/L 的 MG132 。

1.3 不同條件誘導(dǎo)下PC12細(xì)胞分化的評(píng)判

各組PC12細(xì)胞均于誘導(dǎo)4 h后,顯微攝影,計(jì)數(shù)鏡下1 000個(gè)細(xì)胞,并計(jì)數(shù)其中陽(yáng)性細(xì)胞(有突起生出的細(xì)胞）數(shù)量,評(píng)判不同誘導(dǎo)條件下的陽(yáng)性細(xì)胞生成率。陽(yáng)性細(xì)胞的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為,細(xì)胞具有突起,且突起中至少有一根長(zhǎng)度超過(guò)該細(xì)胞的一個(gè)胞體直徑。

1.4 Western blot分析

各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,并經(jīng)冷的0.01mol/LPBS緩沖液洗 3次,離心收集,加細(xì)胞裂解液(50 mM Tris-Cl,pH7.4,150 mM NaCl,5%NP-40,1mM sodium pyrophosphate,2 mM EDTA等）裂解細(xì)胞(1 ml細(xì)胞壓積加入6-10 ml裂解液）,輕輕吹打混勻,離心15 min,12 000轉(zhuǎn),取上清用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)總量,操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各組均取等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,凝膠轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。取該膜行免疫印跡染色,檢測(cè)TrkA受體的磷酸化水平及泛素蛋白表達(dá)。抗體為:抗泛素抗體,抗Phospho-TrkAY490抗體,抗TrkA抗體。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分析

各組細(xì)胞在誘導(dǎo)0,15,30和60 min后,用細(xì)胞分類緩沖液洗兩次(內(nèi)含0.5%BSA,0.05%疊氮鈉,1 mM MgCl2,1 mM CaCl2）,抗TrkA胞外域抗體孵育45 min;細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞分類緩沖液再洗,FITC熒光標(biāo)記物孵育30 min。細(xì)胞分類緩沖液再洗,流式細(xì)胞儀檢測(cè)被熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù),用于檢測(cè)TrkA受體的退化及胞外域的內(nèi)化程度。

2 結(jié)果

2.1 NGF及MG132誘導(dǎo)PC12細(xì)胞突起生成

由于MG132是蛋白酶抑制劑中的一種。文獻(xiàn)報(bào)道蛋白酶抑制可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化,尤其是對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生出突起具有一定的誘導(dǎo)作用。但具有一定的細(xì)胞毒性[16-18,26]。由于不確定在體外培養(yǎng)時(shí),MG132的最佳誘導(dǎo)濃度,我比較了8個(gè)梯度(0.1 μ M,0.25 μ M,0.5 μ M,1 μ M,5 μ M,10 μ M,15 μ M 和 20 μ M）的MG132單獨(dú)誘導(dǎo)下PC12細(xì)胞的分化情況。結(jié)果顯示MG132誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化 24 h后,在8組中,以0.5 μ M組陽(yáng)性細(xì)胞最多,陽(yáng)性率為14.3%。MG132濃度大于10 μ M時(shí),細(xì)胞大量死亡。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中MG132的濃度均選用為0.5 μ M,如圖1。

圖1 不同濃度的MG132聯(lián)合NGF對(duì)PC12細(xì)胞分化的誘導(dǎo)比較

NGF單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí),結(jié)果顯示具有相似的有突起細(xì)胞生成率,約12%。當(dāng)聯(lián)合0.5μ M的MG132作用后,約有18%的細(xì)胞長(zhǎng)出了突起(如圖2）。結(jié)果顯著高于NGF單獨(dú)誘導(dǎo)。這提示聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí),MG132可強(qiáng)化NGF對(duì)PC12細(xì)胞突起生成的誘導(dǎo)。

2.2 蛋白酶抑制劑MG132對(duì)TrkA受體的磷酸化的影響

圖2 MG132聯(lián)合NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞生出突起

流式細(xì)胞術(shù)(抗體為抗TrkA抗體）檢測(cè)了活化TrkA受體退化的情況。結(jié)果,當(dāng)NGF單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí),TrkA受體在初始的15-20 min內(nèi)表達(dá)呈持續(xù)高表達(dá),隨后下降,1 h后并逐漸降至未誘導(dǎo)前水平;當(dāng)NGF聯(lián)合MG132誘導(dǎo)時(shí),TrkA呈在初始的1 h內(nèi)均呈上高表達(dá),隨后下降,3 h后逐漸降至未誘導(dǎo)前水平(圖3）。Western blot方法檢測(cè)了TrkA受體的磷酸化水平(抗體為抗Phospho-TrkAY490抗體）。(圖4）結(jié)果顯示,在NGF或NGF聯(lián)合MG132誘導(dǎo)條件下,TrkA受體都可發(fā)生磷酸化。但NGF單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí),TrkA受體的磷酸化水平持續(xù)的時(shí)間明顯短于NGF聯(lián)合MG132誘導(dǎo)時(shí),結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果一致。這提示聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí),MG132可延長(zhǎng)TrkA受體的磷酸化水平,穩(wěn)定活化的TrkA受體,使之延緩?fù)嘶?/p>

圖3 不同誘導(dǎo)條件下,TrkA受體的退化與內(nèi)化

2.3 蛋白酶抑制劑MG132可影響TrkA受體胞外域的內(nèi)化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞外域的內(nèi)化情況(抗體為抗TrkA胞外域抗體）。結(jié)果顯示NGF單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí),15 min時(shí),有21.16%的細(xì)胞發(fā)生了內(nèi)化(TrkA胞外域抗體陽(yáng)性表達(dá)率78.84%）,30min時(shí),為68.79%,1h時(shí),已近乎100%完全內(nèi)化(為94.95%）。當(dāng)MG132聯(lián)合NGF誘導(dǎo)時(shí),在相同時(shí)間點(diǎn)上,內(nèi)化率明顯增加(圖3）。這提示MG132可加速活化的TrkA受體胞外域的內(nèi)化進(jìn)程。

2.4 泛素在TrkA受體的穩(wěn)定中的作用

Western blot方法檢測(cè)了在不同誘導(dǎo)條件下的PC12細(xì)胞內(nèi)的泛素水平(抗體為抗泛素抗體）。結(jié)果顯示,NGF單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí),PC12細(xì)胞內(nèi)泛素蛋白的表達(dá)水平較高,當(dāng)NGF聯(lián)合MG132誘導(dǎo)后,PC12細(xì)胞內(nèi)泛素蛋白的表達(dá)水平下降(圖3）。

圖4 Western blot檢測(cè)不同條件誘導(dǎo)下,TrkA受體的退化與內(nèi)化及泛素蛋白表達(dá)水平

3 討論

TrkA是NGF的特異性受體,NGF通過(guò)與之結(jié)合可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化,特別是對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生出突起的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)效果與TrkA的磷酸化時(shí)效呈正相關(guān)[4,5]。TrkA是一種跨膜受體,有三個(gè)域,分別為胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域[17]。當(dāng)配體NGF與受體TrkA的胞外域結(jié)合后,TrkA活化:胞內(nèi)域磷酸化;胞外域逐漸由細(xì)胞的表面轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)。胞外域的內(nèi)化將導(dǎo)TrkA受體退化[17]。

在本實(shí)驗(yàn)中我們嘗試NGF與蛋白酶抑制劑MG132聯(lián)合誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化,結(jié)果顯示,MG132可強(qiáng)化NGF對(duì)PC12細(xì)胞分化的誘導(dǎo)。由于NGF誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制與TrkA受體活化有關(guān),我們隨后進(jìn)一步探討了MG132在強(qiáng)化NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的過(guò)程是否亦與TrkA受體活化有關(guān)。由于活化的TrkA受常呈現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象,短時(shí)間很快即退化[5]。我們流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了TrkA受體退化的情況,結(jié)果MG132可顯著的延緩活化的TrkA的退化,而且亦可延長(zhǎng)TrkA受體胞內(nèi)域的磷酸化(Western blot方法檢測(cè)TrkA受體的磷酸化水平）。這提示聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí),MG132可延長(zhǎng)TrkA受體的磷酸化水平,穩(wěn)定活化的TrkA受體,使之延緩?fù)嘶?/p>

由于活化的TrkA受體的退化常與胞外域的內(nèi)化有關(guān)[8-10]。為了進(jìn)一步明晰蛋白酶抑制劑MG132延緩活化的TrkA受體退化的機(jī)制,我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了胞外域的內(nèi)化情況。結(jié)果顯示出人意料的是MG132并沒(méi)如期望的那樣延緩胞外域的內(nèi)化,反而加速了內(nèi)快的進(jìn)程。這提示MG132阻抑活化TrkA的退化并不是通過(guò)阻抑胞外域的內(nèi)化進(jìn)程完成的。

有報(bào)道稱NGF活化TrkA受體的同時(shí),亦使之泛素化。泛素化是誘導(dǎo)活化TrkA受體退化另一條重要途徑[8-10]。既然MG132強(qiáng)化NGF對(duì)PC12細(xì)胞分化的誘導(dǎo)并不是通過(guò)阻抑胞外域完成的,那么極有可能通過(guò)影響TrkA受體的泛素化進(jìn)程來(lái)完成。我們用Western blot方法檢測(cè)了誘導(dǎo)后的PC12細(xì)胞內(nèi)泛素蛋白的表達(dá)量,結(jié)果顯示NGF單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí),PC12細(xì)胞內(nèi)的泛素水平較高,當(dāng)NGF聯(lián)合MG132誘導(dǎo)后,PC12細(xì)胞內(nèi)的泛素水平下降。

總之,蛋白酶抑制劑MG132可有效的強(qiáng)化NGF對(duì)PC12細(xì)胞的誘導(dǎo)作用;其機(jī)制與TrkA受體有關(guān):MG132能加快TrkA受體胞外域的內(nèi)化進(jìn)程;延長(zhǎng)TrkA受體磷酸化時(shí)間,使活化的TrkA受體保持穩(wěn)定;這種穩(wěn)定可能與抑制泛素蛋白過(guò)量表達(dá)有關(guān)。具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

[1]Alfa R W,Tuszynski M H.and Blesch A.A novel inducible tyrosine kinase receptor to regulate signal transduction and neurite outgrowth[J].J Neurosci Res,2009,87:2624.

[2]Huang E.and Reichardt L.Neurotrophins:roles in neuronal development and function[J].Annu Rev Neurosci,2001,24:677.

[3]Huang E.and Reichardt L.Trk receptors:roles in neuronal signal transduction[J].Annu Rev Biochem,2003,72:609.

[4]Geetha T.and Wooten M.W.TrkA receptor endolysosomal degradation is both ubiquitin and proteasome dependent[J].Traffic,200,9:1146.

[5]Moises T.,Wüller S.,Saxena S.,Senderek J.,Weis J.and Kr üttgen A.Proteasomal inhibition alters the trafficking of the neurotrophin receptor TrkA.Biochem[J].Biophys Res Commun,2009,387:360.

[6]Chao M.V.andHempstead B.L.p75 and Trk:a two-receptor system[J].Trends Neurosci,1995,18:321.

[7]Vaudry D.,Stork P.J.,Lazarovici P.and Eiden L.E.Signaling pathways for PC12 cell differentiation:Making the right connections[J].Science,2002,296:1648.

[8]Geetha T.,Jiang J.and Wooten M.W.Lysine 63 polyubiquitination of the nerve growthfactor receptorTrkA directs internalization and signaling[J].Mol Cell,2005,20:301.

[9]Geetha T.,Seibenhener M.L.,Chen L.,Madura K.and Wooten M.W.p62 serves as a shuttling factor for TrkA interaction with the proteasome[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,374:33.

[10]Jadhav T.,Geetha T.,Jiang J.and Wooten M.W.Identification of a consensus site for TRAF6/p62 polyubiquitination[J].Biochem.Biophys.Res.Commun,2008,371:521.

[11]Obin M.,Mesco E.,Gong X.,Haas A.L.,Joseph J.and Taylor A[J].Neurite outgrowth in PC12 cells.J.Biol.Chem,1999,274:11789.

[12]Inoue M.,Zhai H.,Sahazaki H.,Furuyama H.,Fukuyama Y.and Hirima M.TMC-95A,a reversible proteasome inhibitor,induces neurite outgrowth in PC12 cells[J].Bioorg Med Chem Lett,2004,14:663.

[13]Momose I.,Sekizawa R.,Iinuma H.and Takeuchi T.Inhibition of proteasome activity by tyropeptin A in PC12 cells[J].Biosci Biotechnol Biochem,2002,66:2256.

[14]Song E.J.,Hong H.M.and Yoo Y.S.Proteasome inhibition induces neurite outgrowth through posttranslational modification of TrkA receptor[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41:539.

[15]Pasquini L.A.,Paez P.M.,Besio Moreno M.A.,Pasquini J.M.and Soto E.F.Inhibition of the protein by lactacystin enhances oligodendroglial cell differentiation[J].J Neurosci,2003,23:4635.

[16]蔡同建,陳景元,李 妍,季愛(ài)玲,杜可軍,駱文靜.蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)PC12細(xì)胞的增殖抑制作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(12）:1137.

[17]Jay H.Chang,et al.Persistent TrkA Activity Is Necessary to Maintain Transcription in Neuronally Differentiated PC12 Cells[J].The journal of biological chemistry,2003,278(44）:42877.