羥基磷灰石納米顆粒對骨肉瘤MG63抑制作用的體外實驗研究

馮 衛,付 莉,李冬松,劉建國*

(1.吉林大學白求恩第一醫院,吉林長春 130021;2.吉林大學白求恩第二醫院）

納米羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP）作為一種新型生物醫用材料,正在成為骨組織工程研究的熱點,用于骨缺損的治療研究。研究表明納米羥基磷灰石可以作為藥物載體,先前研究表明納米羥基磷灰石對正常細胞沒有抑制作用[1],而體外實驗可以抑制胃癌、喉癌腫瘤細胞[2,3]。但是對骨肉瘤的作用還不十分清楚,本研究的目的是觀察納米羥基磷灰石粒子對骨肉瘤細胞MG63的作用,探討其抑制腫瘤細胞的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料羥基磷灰石納米粒子由四川大學分析測試中心提供,長徑為60-80 nm,直徑為10-20 nm。骨肉瘤細胞MG63細胞株由四川大學華西移植免疫實驗室提供。RPMI1640培養基(Gibco公司）,小牛血清(HyClone公司）,丫啶橙(AO）、溴化已啶(EB）及胰蛋白酶均購自Sigma公司。

1.2 MG63細胞培養MG 63細胞培養于含10%小牛血清的 RPMI1640培養液中,37℃、5%CO2、飽和濕度下培養,隔日換液,每4天按1∶3比例傳代。

1.3 MTT法檢測不同濃度HAP納米粒子對MG63生長的抑制率分別將HAP納米粒子用培養液配制成10、20、50、100、150、200、250、300、350、400mg/L 10種濃度。將MG63細胞按1×103/孔接種于96孔板中,每孔加入培養基180μ l,于 37℃、5%CO2 下培養24 h后仔細吸出孔內培養液,分別加入上述不同濃度的HAP納米粒子,對照組加入等量培養液,每濃度重復4孔。48 h后進行MTT法檢測,酶標儀檢測各孔OD值(λ=492 nm）,記錄結果,計算每種HAP濃度對細胞的抑制率。并計算30%抑制濃度(30%Inhibiting concentration,IC30）,50%抑制濃度(IC50）和70%抑制濃度(IC70）。抑制率=100%×(試驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值

1.4 IC30、IC50、IC70濃度HAP對MG63生長抑制作用的時效曲線 將MG 63細胞接種于96孔板中,每孔接種1×103個細胞,24 h后隨機分為IC30組、IC50組、IC70組和空白對照組,每組24孔。分別加入IC30、IC50、IC70 3種濃度HAP,空白對照組加入培養液。隨后每天每組4孔MG63細胞進行MTT檢測,重復6天。按照上述公式計算抑制率,繪制這3種濃度HAP對MG63抑制作用時效曲線。

1.5 AO/EB染色觀察HAP作用后MG63細胞形態學改變 接種MG63細胞于6孔板中,24 h后加入IC50濃度的HAP,對照組加培養液。48 h后棄培養液,加入含AO/EB(濃度為100 mg/L）的培養液,熒光顯微鏡觀察HAP作用后MG63細胞的形態。

1.6 流式細胞術分析收集經IC 50濃度的HAP作用48 h的細胞和對照組細胞,每組10個標本,用預冷的70%乙醇固定48 h,離心后棄上清,PBS調整細胞密度至1×109/ml,RNA酶消化,50 mg/L PI染色,流式細胞儀檢測,Multicycle軟件分析各細胞周期比例,亞二倍體峰G1法分析細胞凋亡率。

1.7 統計學分析采用SPSS 10.0統計軟件對實驗數據進行統計學處理,進行t檢驗、方差分析。計量資料采用(±s）表示。

2 結果

2.1 MTT法檢測不同濃度HAP納米粒子對MG63生長的抑制率 濃度在0-400 mg/L范圍內變化時,HAP對MG63均有不同程度抑制作用,見表1。當HAP濃度低于150 mg/L時,隨著藥物濃度增大,對細胞抑制率明顯增加,10、20、50、100 mg/L這4種濃度的抑制率之間有統計學差異,P＜0.05。當HAP濃度大于150 mg/L后,抑制率不再明顯增加,進入平臺期,各濃度的抑制率之間無統計學差異,P＞0.05。根據內插法計算 IC30、IC50、IC70分別為12.50 mg/L、39.10 mg/L和 86.31 mg/L。

表1 不同濃度HAP納米粒子對MG63的抑制作用(λ=492nm）

2.2 IC30、IC50、IC70濃度HAP對MG63生長抑制作用的時效曲線 見圖1,這3種濃度HAP對MG63的抑制作用均隨時間的延長而增加,在3天內抑制率的增長快,而在3天之后,增加速度明顯減慢,表明HAP納米粒子對MG63生長抑制作用主要發生在3天內。

2.3 AO/EB染色觀察HAP作用后MG63細胞形態學改變 正常對照組的細胞數量較多,生長良好,而HAP作用后的細胞數量減少,凋亡細胞較多,凋亡細胞早期表現為細胞核呈濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片,晚期表現為核碎裂呈濃染的紅色碎片。

圖1 HAP納米粒子作用于MG63的時效曲線

2.4 流式細胞術分析HAP組的細胞凋亡率為19.03±5.80,正常對照組為12.32±3.84,兩組間差異顯著(P＜0.05）。HAP組G0/G1期細胞顯著增多,S期細胞顯著減少,同正常對照組相比兩組間差異顯著(P＜0.05）。

3 討論

納米羥基磷灰石(HAP）由于顆粒尺寸的細微化使比表面積急劇增加的特點,具備和普通羥基磷灰石粒子不同的理化性能,如溶解度高、表面積大、生物活性更好等,且近年來的研究發現納米HA有抗肝癌和舌癌等作用[4,5],其抗癌普廣、作用溫和,還可以作為藥物載體用于疾病治療,是一種生物相容性更好的治療材料。

將HAP納米粒子與MG63共培養進行MTT細胞毒性試驗,發現HAP納米粒子在不同濃度范圍變化時,對MG63有不同程度的抑制作用生長,當濃度低于150 mg/L時,隨著藥物濃度的增大,對細胞的抑制率明顯增大,呈量效依賴關系。在實驗最初的3天內HAP對MG63的生長抑制率明顯增加,3天后生長抑制率減慢并進入平臺期,結果表明HAP對MG63的生長抑制敏感期在3天內。實驗結果提示選定IC50濃度為39.10 mg/L的HAP納米粒子進一步進行實驗研究。

目前對HAP納米粒子對腫瘤細胞的抑制作用機理還不十分清楚,誘導腫瘤細胞凋亡是治療惡性腫瘤的一條有效途徑。Bauer[6]研究發現小于100 nm的針狀HAP納米粒子具有較低的結晶度和較高的表面活化能,當HAP納米粒子與癌細胞表面接觸,HAP納米粒子是以能量依靠型網格蛋白介導的細胞內吞噬作用方式進入細胞體內。Chen等[7]認為由于腫瘤細胞的吞噬能力較強,納米粒子以非受體介導的直接吞噬方式進入腫瘤細胞內部,與線粒體、溶酶體或高爾基體等結合發生化學反應,導致溶酶體破裂或釋放各種酶,啟動細胞凋亡。其研究發現納米HAP可以顯著降低腫瘤細胞活性,誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡,活化Caspase-3和Caspase-9。同時研究發現HAP納米粒子的抗癌活性和誘導腫瘤細胞凋亡能力與粒子的大小密切相關,粒子在20-80 nm范圍內可以有效激活caspase-3和Caspase-9,降低Bcl-2蛋白水平,同時增加Bax蛋白表達和細胞色素C的釋放[8]。本研究所制備的HAP納米粒子長徑約為60-80 nm,直徑約為10-20 nm,我們推測HAP納米粒子可能通過腫瘤細胞的直接吞噬作用后進入細胞內部,與DNA結合并誘導腫瘤細胞凋亡。

通過熒光顯微鏡觀察發現,經HAP作用過的MG63細胞形態學方面出現凋亡特征,細胞核濃縮,細胞核發生碎裂和濃染,結果提示HAP可能損傷DNA,誘導MG63細胞的凋亡。本研究通過流式細胞術定量分析了HAP組細胞的凋亡率(19.03±5.80）%,明顯高于對照組。同時本研究發現HAP組的S期細胞明顯少于對照組,而G0/G1期細胞明顯多于對照組,因此認為HAP納米粒子對腫瘤細胞的作用可能具有細胞周期特異性,作用于細胞的S期,損傷DNA鏈、阻止DNA的合成、復制,導致S期細胞凋亡,使細胞不能繼續進入G2期,最終不能完成細胞分裂和增殖。

綜上所述,HAP納米顆粒對MG63有明顯的抑制作用,并誘導腫瘤細胞凋亡。

[1]Hideki A,MasatakaO,Seisuke K.Effects of HAP-sol on cell growth[J].Report of the Institute forMedical and Dental Engineering,1992,26:15.[2]Zhang S,Li S,Chen F.Studies on effects of apatite ultrafine powder on cancer cells[J].J Wuhan University of Technology,1996;18(1）:5.

[3]Aoki H,Ogaki M,Kano S.Effects of Adriacin-absorbing hydroxyapatitesol on Ca-9 cell growth[J].Rep Inst Med Dent Eng,1993,27(1）:39.

[4]劉志蘇,唐勝利,艾中立,等.羥基磷灰石納米粒子對人肝癌和結腸癌細胞生長的抑制作用[J].中華實驗外科雜志,2006,23(3）:266.

[5]陳超,王慧明.納米羥基磷灰石溶膠對人舌癌細胞株的作用研究[J].實用腫瘤雜志,2003,18(6）:459.

[6]Bauer IW,Li SP,Han YC,etal.Internalization of hydroxyapatite nanoparticles in liver cancer cells[J].J Mater Sci Mater Med,2008,19(3）:1091.

[7]Chen X,Deng C,Tang S,et al.Mitochondria-dependent apoptosis induced by nanoscale hydroxyapatite in human gastric cancerSGC-7901 cells[J].Biol Pharm Bull,2007,30(1）:128.

[8]Yuan Y,Liu C,Qian J,et al.Size-mediated cytotoxicity and apoptosis of hydroxyapatite nanoparticles in human hepatoma HepG2 cells[J].Biomaterials,2010,31(4）:730.