薯蕷皂苷元誘導(dǎo)人胃低分化粘液腺癌MGC-803細(xì)胞凋亡依賴caspase-3途徑

何忠梅,張顯濤,王鐵成

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林長(zhǎng)春 130118;2.修正藥業(yè)集團(tuán)長(zhǎng)春高新制藥有限公司;3.吉林天藥科技有限公司）

薯蕷皂苷元(Diosgenin,Dio）是從我國(guó)特有的薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino中分離得到的一種植物甾體化合物,具有降血脂[1]、降血糖[2]、促進(jìn)膽汁分泌[3]、抗血栓[4]、抗心肌缺血[5]、抗風(fēng)濕[6]、抗炎[7]等作用,而它的抗腫瘤作用[8-10]更是引起了研究者的極大關(guān)注。Dio能夠誘導(dǎo)人紅白血病細(xì)胞和人白血病細(xì)胞分化和凋亡[11],誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡和人黑色素瘤細(xì)胞凋亡[12],具有明顯抑制移植胃低分化粘液腺癌(MGC-803）荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用[13],Dio還能明顯抑制MGC-803細(xì)胞的分裂和集落形成[14],能引起其形態(tài)改變并影響其DNA的合成[15],而關(guān)于Dio是否能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡及其凋亡途徑的研究,至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要在離體條件下,探討Dio對(duì)MGC-803細(xì)胞的促凋亡作用及caspase-3對(duì)凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑

MGC-803細(xì)胞株購(gòu)自吉林省腫瘤醫(yī)院。CK2TRC-3熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS公司）;D-63450-CO2培養(yǎng)箱(Hera公司）;FCANF129004酶標(biāo)儀(TECAN公司）;流式細(xì)胞儀(BD公司）;96孔培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶(NUNCTM）;RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone）;新生牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所）;Annexin V-FITC和APO-BRDU細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、四唑藍(lán)(MTT）、Ac-DEVD-CHO和 A-DEVD-AFC均為Sigma公司產(chǎn)品。Diosgenin亦為Sigma公司產(chǎn)品,用無(wú)水乙醇和二甲基亞砜配制成高濃度溶液備用,二者的終濃度均低于0.1%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)12 h后加入diosgenin濃度分別為 0,1.875,3.75,7.5,15,30,60 μ g?ml-1,分別于0,24,48,72 h用MTT方法測(cè)定細(xì)胞死亡率。或者在加入 caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO 60min后,再加入不同濃度的diosgenin。

1.2.3 Annexin V-FITC檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞 按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4 APO-BRDU檢測(cè)凋亡晚期細(xì)胞 按照APOBRDU Kit說(shuō)明書操作。

1.2.5 Caspase-3活力測(cè)定 將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)12 h后加入diosgenin濃度分別為0,15,30 μ g?ml-1,24 h 后收集細(xì)胞 ,加入 100 μ l裂解液重懸細(xì)胞,冰浴10 min。12 000 rpm,4℃,3 min沉淀細(xì)胞碎片。上清液轉(zhuǎn)至另一新管中,加入100 μ l 2×反應(yīng)buffer,加 入 A-DEVD-AFC 使其 終濃 度為 50 μ M,混勻,37℃,60 min水浴后轉(zhuǎn)移至不透光96孔板中,酶標(biāo)儀(Ex=400 nm,Em=505 nm）測(cè)定熒光。結(jié)果以給藥組的熒光與對(duì)照組的熒光的比值表示即F(treatment）/F(control）,簡(jiǎn)稱 F(t）/F(c）。

2 結(jié)果

2.1 Dio對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響

Dio對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用呈明顯的時(shí)-效和量-效關(guān)系。隨著Dio濃度的增加,作用時(shí)間的延長(zhǎng),其殺傷MGC-803細(xì)胞的能力也隨之增強(qiáng)。經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計(jì),用直線回歸方程計(jì)算其作用24、48、72 h IC50值為 56.290、27.837、17.723 μ g?ml-1。當(dāng) diosgenin 達(dá)到較高濃度(30、60 μ g?ml-1）時(shí),對(duì)MGC-803細(xì)胞的增殖抑制作用在48和72 h已十分接近,因此,48 h高濃度Dio已基本發(fā)揮較大效用。

2.2 Annexin V-FITC檢測(cè)Dio處理后的凋亡早期細(xì)胞

細(xì)胞漿膜不對(duì)稱性喪失導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸(PS）外翻是細(xì)胞凋亡的早期過(guò)程,Annexin V可與PS特異性強(qiáng)烈結(jié)合,被用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。Annexin V-FITC+/PI-雙標(biāo)檢測(cè)可見(jiàn),與陰性對(duì)照組比較,隨著作用濃度的不斷提高,Dio組凋亡細(xì)胞呈劑量依賴性增多,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 通過(guò)Annexin V-FITC檢測(cè)Dio是否誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞發(fā)生早期凋亡

2.3 APO-BRDU檢測(cè)Dio處理后的凋亡晚期細(xì)胞

核酸內(nèi)切酶活化是凋亡晚期細(xì)胞的一個(gè)特征變化,活化的內(nèi)切酶將DNA斷裂成不連續(xù)的、不同倍數(shù)的180-200 bp的小核酸片段。這是目前判斷細(xì)胞凋亡的一項(xiàng)重要生化指標(biāo),這種凋亡細(xì)胞的DNA斷裂碎片,可以通過(guò)APO-BRDU試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨Dio劑量增大,DNA斷裂碎片增多,凋亡細(xì)胞逐漸增多,當(dāng)Dio濃度達(dá)到60 μ g/ml時(shí),凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)已由陰性對(duì)照組的1.48%增至30.08%,見(jiàn)表2 。

2.4 Dio對(duì)MGC-803細(xì)胞中caspase-3活性的影響

Caspase-3被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行者,在腫瘤細(xì)胞凋亡中起著十分重要的作用。結(jié)果顯示,15、30 μ g/ml Dio作用MGC-803細(xì)胞24 h后,MGC-803細(xì)胞中caspase-3活性顯著增加(見(jiàn)圖1）。隨Dio作用濃度的增大,caspase-3活性也隨之增強(qiáng)。

表2 通過(guò)APO-BRDU檢測(cè)Dio是否誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡

圖1 Dio對(duì)MGC-803細(xì)胞中 caspase-3活性的影響

2.5 Caspase-3特異性抑制劑DEVD-CHO對(duì)Dio誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞死亡的影響

15 μ g/mL Dio 作用MGC-803 細(xì)胞 24 h,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為46.91%,而先用DEVD-CHO預(yù)處理細(xì)胞1 h后再用Dio作用細(xì)胞,其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率已降為18.79%(見(jiàn)表3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,caspase-3抑制劑DEVD-CHO能阻斷Dio誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞死亡。

表3 DEVD-CHO對(duì)Dio抑制MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3 討論

從天然產(chǎn)物中尋找活性成分,已經(jīng)成為當(dāng)今抗腫瘤藥物發(fā)展戰(zhàn)略之一。Dio是從天然中草藥薯蕷科植物中提取的抗腫瘤活性成分。在對(duì)Dio進(jìn)行抗MGC-803細(xì)胞作用機(jī)制的研究中,我們用AnnexinVFITC試劑盒檢測(cè)到了凋亡細(xì)胞早期的變化即細(xì)胞漿膜不對(duì)稱性喪失導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸(PS）外翻,在APO-BRDU分析中,檢測(cè)到凋亡細(xì)胞斷裂的DNA碎片,證實(shí)了Dio誘導(dǎo)人胃低分化粘液腺癌MGC-803細(xì)胞凋亡。

藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理十分復(fù)雜,許多基因的變化參與此過(guò)程,但經(jīng)典途徑是caspases途徑。為進(jìn)一步探討Dio誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制,我們主要考察了caspase-3在此過(guò)程中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Dio能激活MGC-803細(xì)胞中的caspase-3,增強(qiáng)caspase-3活力,caspase-3特異性抑制劑DEVD-CHO能阻斷Dio誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞死亡的作用,證實(shí)Dio誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡依賴于caspase-3途徑。

霍銳等人報(bào)道Dio未導(dǎo)致人黑色素瘤細(xì)胞A375-S2中caspase-3活力升高[14],而我們的實(shí)驗(yàn)證明Dio能激活MGC-803細(xì)胞中的caspase-3,增強(qiáng)caspase-3活力,說(shuō)明Dio通過(guò)不同途徑誘導(dǎo)不同腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

雖然我們的實(shí)驗(yàn)證明Dio誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡依賴于caspase-3的激活,但如何激活caspase-3還不清楚。caspase-3主要位于整個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)的下游,caspase-8和caspase-9均位于其上游,Dio誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡具體是通過(guò)caspase-8介導(dǎo)的死亡受體途徑還是caspase-9介導(dǎo)的線粒體途徑,還有待于進(jìn)一步探討。

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