生長抑素受體1在皮質發育障礙大鼠海馬的異常表達

張建剛 宋延波 張 毅 賀 興 馮 飛 晏 勇

重慶醫科大學第一附屬醫院 1)神經內科 2)腫瘤科 重慶 400016

皮質發育障礙(DCDs)是一種大腦皮質發育異常,包括大腦皮質的神經元正常而結構異常的腦畸形。目前DCDs發生率仍然不清楚,但隨著磁共振影像(MRI)的應用,DCDs的診斷率明顯增加。估計25%～40%的難治性或耐藥性小兒癲由DCDs引起[1],且至少75%的DCDs病人患有癲[2]。DCDs的發生是由正常的皮質神經元的異位或異常的皮質神經元出現所造成,而這些異常的神經元導致皮質的異常網絡形成。影響胚胎期神經元移行的因素很多,如基因突變、射線、冰凍、化學藥物等。因此國內外學者利用射線照射、液氮冷凍以及化學藥物甲基氧化偶氮甲醇注射的方法建立神經元移行異常的動物模型。一定劑量的射線會造成移行神經元的死亡,Hicks等[3]發現幼稚的、正處于遷移狀態的神經元對射線的損傷敏感度較高。本課題組選擇X射線照射的方法建立神經元移行異常的模型,并在前期的工作中通過對皮質發育障礙大鼠模型大腦組織進行基因芯片的篩查發現了一些導致神經元遷移紊亂的基因。本實驗對其中的生長抑素受體1進一步研究探討皮質發育障礙神經元遷移紊亂的機制及其致癲機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 6只SD孕鼠用于實驗(由第三軍醫大學大坪醫院動物中心提供),體質量300～350 g。幼鼠出生當天計為P0,飼養于12 h光照/12 h黑暗的環境,自由進食。6只孕鼠實驗按需要完全隨機分成2組,皮質發育障礙組3只孕鼠和3只正常對照組孕鼠各出生30幼鼠,P60時在保持性別比例對等的前提下完全隨機各選取5只進行免疫組化檢測,5只進行Western Blot檢測。

1.2 X射線照射誘導的皮質發育障礙模型的建立 將3只孕15 d SD大鼠分別放入長20 cm、寬10 cm、高 10 cm的紙盒中,置于直線加速器治療機進行X射線照射,照射劑量200CGY,劑量率200CGY/min,時間60 s[4]。照射后的孕鼠正常喂養待其分娩。幼鼠在其出生后21 d斷奶。常規飼養至60 d。

1.3 免疫組化檢測 sstr-1免疫組化采用SABC法。檢測方法：二甲苯浸泡脫蠟,梯度酒精脫水,枸櫞酸緩沖液抗原修復20 min,3%H2O2滅活內源性酶15 min,正常山羊血清封閉抗原30 min,去除血清,加入兔抗sstr-1多克隆抗體(Santa Cruz公司,濃度為1∶200),37℃孵育2 h。根據SABC試劑盒完成ABC步驟。以上每一步驟之后均用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,p H=7.2～7.6)洗滌3次,每次5 min。DAB顯色后用去離子水洗滌,然后經蘇木素復染,二甲苯透明,最后中性樹膠封片。

1.4 Western Blot檢測 快速斷頭取大鼠海馬,按常規進行組織蛋白質提取,運用BCA法測定蛋白質的濃度,取約50 μL蛋白質用于15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉移至PVDF膜后,用TBST緩沖液室溫封閉1 h,加入兔抗sstr-1蛋白抗體(1∶200)或兔抗β-actin抗體(1∶2000)(Santa Cruz公司),在4℃下孵育過夜,用 TBST溶液洗膜4次,每次8 min。室溫下相應加入羊抗兔IgG(北京中杉1∶2000)抗體孵育2 h,然后采用同法洗膜4次,應用增強型化學發光試劑(Santa Cruz公司)顯色,最后凝膠成像分析系統攝像。

1.5 統計學分析 用SPSS 15.0軟件包對數據進行統計學分析。描述性數據以均數±標準差(±s)表示,兩獨立樣本均數間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化 皮質發育障礙組大鼠海馬區sstr-1陽性細胞的數量明顯減少,染色強度也明顯減弱。特別是在海馬的CA 1區減少更為明顯。皮質發育障礙組大鼠海馬區sstr-1的表達主要集中在神經元細胞的胞漿。在正常情況下,正常組大鼠海馬區神經元細胞的胞漿中有一定強度的sstr-1表達。見圖1。

圖1 sstr-1免疫組化染色 a 正常對照組大鼠海馬中高表達(4×10);b 皮質發育障礙組大鼠海馬中低表達(4×10);c 正常對照組大鼠海馬免疫反應陽性細胞,陽性表達部位主要在細胞核(40×10);d 皮質發育障礙組大鼠海馬免疫反應陽性細胞,陽性表達部位主要在細胞核(40×10);箭頭：陽性細胞

圖2 皮質發育障礙組和正常對照組大鼠海馬sstr-1 Western Blot結果分析 A 對照組泳道為 1、3、4、7、8;皮質發育障礙組泳道為 2、5、6、9、10;sstr-1 條帶在 65 k D,β-actin條帶在42 k D;β-actin作為陽性參照 B DCDs組 sstr-1平均OD值顯著低于對照組(*P＜0.05)

2.2 Western Blot 免疫印跡檢測結果顯示膜上約65 kD的位置上可見黑色陽性雜交帶,即為sstr-1蛋白表達,從雜交信號的強度看,皮質發育障礙大鼠海馬組織標本中的sstr-1蛋白表達明顯弱于對照組;β-actin的陽性雜交條帶出現在42 kD的位置。使用Quantity one采圖分析軟件得出每個條帶的平均OD值(每個目的條帶與相應的β-actin OD值的比值),DCDs組的平均OD值為0.59±0.15,對照組的平均OD值為 1.02±0.14(P＜0.05)。見圖2。

3 討論

sst家族分為5個亞型,sstr-1即生長抑素受體1,它的基因定位于6q23。在海馬區主要分布在CA 1區、齒狀回、內嗅皮質。功能較為復雜：(1)sstr-1與神經肽Y一起作用對細胞的活動起啟動作用[5-6]。原位雜交法發現sstr-1和神經肽Y在大鼠下丘腦內側基底部的細胞中共表達。也有關于sstr-1與生長激素釋放激素在漏斗核細胞共表達的報道[7]。其他組織關于sstr-1的研究也很多。Watt等[8]發現在乳腺癌細胞有sstr-1和sstr-5表達,而且表達量與腫瘤體積成正比,與瘤細胞分化程度成反比。提示sstr-1可能對于低分化細胞的增值、分化等有一定作用。生長發育的神經元中的sstr-1可能有相似的作用。(2)有人采用基因敲除技術觀察sstr-1(-/-)小鼠模型胰島素分泌以及內環境穩定情況意外發現sstr-1(-/-)模型鼠除了表現內環境的紊亂外,還明顯表現出來軀體生長發育遲滯[9]。

我們前期的基因芯片掃描發現sstr-1基因表達下調,本實驗的前期結果顯示皮質發育障礙組大腦外形與正常組相比明顯變小,體積縮小。HE染色顯示皮質發育障礙大鼠海馬區特別是CA1出現明顯的神經元遷移紊亂。說明X射線誘導的皮質發育障礙大鼠模型是能夠很好地模擬人的皮質發育障礙。在免疫組化中皮質發育障礙大鼠模型海馬區sstr-1的表達減少,特別是在海馬的CA1區顯著減少,Western Blot蛋白定量進一步顯示在皮質發育障礙大鼠模型的海馬區sstr-1表達下調。本實驗模型表現的大腦發育障礙及癲易感性的特點,sstr-1下調很可能起了重要作用。

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