兔激素性股骨頭缺血性壞死模型 BMSCs超微結(jié)構(gòu)觀察

鞏 凡，張 焱，白志剛，牛東生*

(1寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004;2寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院)

激素性股骨頭缺血性壞死(SANFH)是因?yàn)榇罅繎?yīng)用皮質(zhì)類固醇類激素，造成股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等死亡或凋亡所引起的病理過程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs)是一種主要存在于骨髓中，具有多向分化能力的干細(xì)胞。2010年 3月，我們觀察了兔 SANFH模型的 BMSCs的超微結(jié)構(gòu)，探討SANFH的成因及對(duì)骨修復(fù)的影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年新西蘭大白兔 10只(體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供);馬血清(鄭州益康生物工程有限公司);醋酸潑尼松龍(25 mg/ml，中國(guó)浙江仙據(jù)制藥股份有限公司);青霉素鈉:0.48 g(80萬 U，石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司);Percoll細(xì)胞分離液(Pharmacia 1.073 g/ml);L-DMEM(Gibco公司);PBS(Sigma公司 );肝素鈉注射液(12 500 U/2 ml，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 參考相關(guān)文獻(xiàn)[1]，10只健康的成年新西蘭大白兔分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng) 3 d后每只經(jīng)耳緣靜脈注射馬血清 10 ml/kg 1次，間隔兩周后再注射 1次。繼續(xù)喂養(yǎng)兩周后肌肉注射醋酸潑尼松龍 8 mg/kg，間隔 1 d注射 1次，共 5次。繼續(xù)喂養(yǎng) 3～5周后行 X線檢查，觀察結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨小梁中出現(xiàn)大量空骨陷窩及核固縮現(xiàn)象，符合激素性股骨頭缺血性壞死的病理學(xué)定義[2，3]，說明制模成功。為預(yù)防感染，所有試驗(yàn)動(dòng)物每周給予肌肉注射青霉素鈉 20萬 U/只。

1.2.2 細(xì)胞分離及超微結(jié)構(gòu)觀察 予制模前及制模后 2個(gè)月行骨髓細(xì)胞分離:將新西蘭大白兔俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，3%戊巴比妥鈉 1 ml/kg(30 mg/kg)耳緣靜脈緩慢注射麻醉，備皮，碘伏消毒皮膚。選取股骨近端外側(cè)將 F16骨髓穿刺針定位，待骨髓穿刺針有明顯落空感時(shí)，抽出穿刺針內(nèi)芯，于穿刺針尾部接入 10 ml注射器(內(nèi)含 12 500 U肝素 1 ml)負(fù)壓抽吸，每次穿刺抽取 5 ml骨髓液。抽取的骨髓立刻進(jìn)入無菌間，與等體積的不含血清的 L-DMEM培養(yǎng)基混勻，500 r/min離心 5 min，棄上清液，用 5.0 ml不含血清的 L-DMEM培養(yǎng)基混勻，緩慢加入預(yù)先加有 5.0 ml密度為 1.073 g/ml的 Percoll分離液的離心管內(nèi)，使其位于 Percoll分離液的液面上，靜置 5 min，1 500 r/min離心 30 min。可見管內(nèi)液體分為四層，最上層約占液柱的 1/2，為紅色的培養(yǎng)液層，第三層約占液柱的 1/2，為乳白色的 Percoll分離液層，兩層交界處為高約 1.0 mm的灰白色云霧狀層，為單個(gè)核細(xì)胞層，底層緊貼試管壁，為一薄層紅色細(xì)胞層，為紅細(xì)胞等。小心吸去最上層的紅色培養(yǎng)液，緩慢加入 2%戊二醛固定 2 h(4℃)，待灰白色云霧層固定成塊后，小心將固定塊挑出，放入小瓶中，4℃、2%戊二醛繼續(xù)固定 30 min，換 0.1 M二甲砷酸鈉緩沖液沖洗 3次，0.1 M二甲砷酸鈉緩沖液保存(4℃)。1%鋨酸浸泡染色 2 h(4℃)。梯度乙醇脫水。環(huán)氧丙烷滲透 2次。完全樹脂包埋后入模具。修整模塊，切片，定位，超薄切片，于電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

制模前 BMSCs:低倍下見少量紅細(xì)胞及兩個(gè)并排的 BMSCs，細(xì)胞核較大核膜完整;細(xì)胞質(zhì)豐富，電子密度均一，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰。并可見另一 BMSCs，細(xì)胞質(zhì)濃縮聚集，核膜不完整;細(xì)胞質(zhì)電子密度增高，其間細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清。高倍下見雙層核膜完整，細(xì)胞核較大，染色質(zhì)分布均勻，核內(nèi)染色質(zhì)豐富，核孔較多;細(xì)胞質(zhì)豐富，電子密度均一，細(xì)胞器豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰。制模后 BMSCs:低倍下見少量紅細(xì)胞及一個(gè)淋巴細(xì)胞。其中可見兩個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、聚集并出現(xiàn)凋亡小體。高倍下見胞體變小，胞質(zhì)基質(zhì)密度增加。細(xì)胞核不完整，核膜模糊，染色質(zhì)固縮、凝集;細(xì)胞質(zhì)濃縮，電子密度增高，胞質(zhì)內(nèi)見大小不等的空泡及大量脂滴，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清。

3 討論

BMSCs能夠分化為多種組織細(xì)胞，包括骨、軟骨、脂肪、肌腱細(xì)胞等。關(guān)于激素性股骨頭缺血性壞死的致病原因，目前尚有爭(zhēng)議，其中以骨質(zhì)疏松、血液高凝狀態(tài)、血管內(nèi)凝血、脂肪代謝紊亂、骨內(nèi)高壓等較為普遍。激素性股骨頭缺血性壞死的致病過程極其復(fù)雜[2]，上述原因并不是孤立存在，而是相互聯(lián)系。其中脂肪代謝紊亂學(xué)說認(rèn)為與激素導(dǎo)致骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞聚集、肥大有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物應(yīng)用激素后股骨頭內(nèi)脂肪細(xì)胞肥大，并見大的脂肪滴形成;而脂肪滴旁發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞普遍出現(xiàn)功能障礙的特征:①胞質(zhì)內(nèi)空泡形成:可能是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹所致，說明細(xì)胞有氧呼吸及蛋白合成可能受到干擾;②自噬體出現(xiàn):提示細(xì)胞出現(xiàn)衰老;③胞質(zhì)內(nèi)大量脂滴出現(xiàn):說明細(xì)胞的脂類代謝功能可能受到影響。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用激素前只有少量 BMSCs出現(xiàn)了凋亡，此與成年動(dòng)物細(xì)胞正常衰老有關(guān)。應(yīng)用激素后大量的 BMSCs出現(xiàn)凋亡或細(xì)胞器受損，胞質(zhì)中看到空泡和大量脂滴形成，提示激素可能通過影響細(xì)胞的正常脂類代謝使其過早出現(xiàn)功能異常，并可能引發(fā)其啟動(dòng)凋亡程序，此進(jìn)一步印證了 Wang等[4]的研究，他們發(fā)現(xiàn)大量使用糖皮質(zhì)激素可以使BMSCs減少;其在對(duì)成骨細(xì)胞的觀察中胞質(zhì)內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)脂滴，僅看到腫脹的線粒體及自噬體，證明有氧呼吸被干擾沒有引起脂類代謝紊亂。

本研究中采用 Percoll細(xì)胞分離液分離 BMSCs后不經(jīng)培養(yǎng)，直接固定，減少了細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響及各種人工培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞器的損害，觀察到的細(xì)胞狀態(tài)更符合其體內(nèi)狀態(tài)，結(jié)果與喬?hào)|訪等[5]體外培養(yǎng)的兔 BMSCs觀察結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，激素導(dǎo)致股骨頭缺血壞死的可能機(jī)制為通過對(duì)血液系統(tǒng)的干擾，影響股骨頭內(nèi)各種細(xì)胞的有氧呼吸;又通過干擾 BMSCs的脂類代謝影響骨的修復(fù)，最終導(dǎo)致股骨頭壞死塌陷。

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[4]Wang BL，Sun W，Shi ZC，et al.Decreased proliferation of mesenchymal stem cells in corticosteroid-induced osteonecrosis of femoral head[J].Orthopedics，2008，31(5):444.

[5]喬?hào)|訪，路艷蒙，傅文玉，等.體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].電子顯微學(xué)報(bào)，2002，21(5):491-492.