骨質(zhì)疏松癥大鼠血液中堿性磷酸酶來源方式探討

林社裕，譚湘陵

(南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南通 226007)

當(dāng)前國內(nèi)外的骨質(zhì)疏松癥的研究主要集中于骨質(zhì)疏松癥的病因及各種生化檢測指標(biāo)[1～6]。關(guān)于骨質(zhì)疏松癥患者血清堿性磷酸酶(ALP)水平目前報道不一，其來源方式亦存在爭議。有學(xué)者認(rèn)為系骨質(zhì)疏松癥發(fā)生時靜止的成骨細(xì)胞變?yōu)榛钴S的成骨細(xì)胞，釋放大量的 ALP入血所致;據(jù)此理論治療后ALP應(yīng)進(jìn)一步升高，但事實卻與此相反。2009年，我們檢測了骨質(zhì)疏松癥大鼠血清 ALP水平，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其來源方式。

1 材料與方法

1.1 材料 40只健康 SD雌性大鼠，4個月齡，體質(zhì)量 250～280 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。正置金相顯微鏡(Leica DM2500);冰凍切片機(Lei ca CM1900);地高辛隨機引物標(biāo)記檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);即用型 SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);DIG DNA標(biāo)記試劑盒(上海美季生物技術(shù)有限公司);尼龍膜(羅氏公司);Rabbit Anti-Alkaline Phosphatase(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 模型制備及 ALP檢測 將 40只大鼠隨機分為模型組和假手術(shù)組(對照組)各 20只。模型組腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，無菌環(huán)境下打開腹腔，摘除卵巢，腹腔分層縫合，肌注青霉素(2萬 U/只)。對照組不卵巢摘除，其他操作與模型組相同。術(shù)后 3個月兩組均頸椎脫臼處死，取股骨去盡肌肉與結(jié)締組織，截取相應(yīng)骨組織浸入 4%多聚甲醛中固定 3 d，再浸入 4%EDTA溶液中室溫脫鈣 4周，每周換液1次。脫鈣完成后，取骨組織制作冰凍切片(切片厚度 10μm)，貼片于包被多聚賴氨酸的載玻片上行ALP檢測。①ALP mRNA:采用原位雜交法。冰凍切片首先探針制備(PCR法)，效價驗證;室溫風(fēng)干，0.1 MPBS浸 10 min，0.1 M甘氨酸/0.1 MPBS浸 5 min，0.3%TritonX-100/0.1 M PBS浸 15 min，0.1 M PBS洗 3次，蛋白酶 K 37℃孵育 30 min，4%多聚甲醛浸 5 min，0.1 M PBS洗 2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M三乙醇胺中10 min，預(yù)雜交 42℃ 30 min，42℃雜交過夜，洗片，3%BSA/0.05 M PBS包被 30 min，滴加抗地高辛-HRP標(biāo)記的一抗，4℃孵育過夜，0.05 M PBS洗 4次;TSM1洗 2次，TSM2洗 2次，顯色，乙醇梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。②ALP蛋白:冰凍切片室溫風(fēng)干，多聚甲醛固定，H2O2室溫浸泡，蒸餾水洗，5%BSA封閉，加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。原位雜交和免疫組化圖片應(yīng)用 Scion Image軟件固定，隨機選擇 5個視野行灰度值檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS15.0統(tǒng)計軟件。多組計量資料均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組 ALPmRNA染色強度明顯低于對照組，且其表達(dá)主要位于骨組織邊緣，兩組 ALPmRNA表達(dá)的灰度值分別為 43.64、62.42(P＜0.01)。兩組ALP蛋白表達(dá)特點與 ALP mRNA相同，亦主要位于骨組織邊緣。模型組及對照組 ALP蛋白表達(dá)的灰度值分別為 49.8、90.7(P＜0.01)。

3 討論

根據(jù)免疫組化結(jié)果可以看出，經(jīng)過去勢后，模型組 ALP含量明顯降低。原因為去勢后，大鼠體內(nèi)的雌激素的分泌量減少，破壞了體內(nèi)的激素的平衡，影響了機體的正常代謝，對骨骼而言，出現(xiàn)了破骨細(xì)胞骨吸收活性增強，而成骨細(xì)胞的骨形成活性有所減弱，打破了骨骼重建的動態(tài)平衡[7]。ALP主要由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，主要作用是產(chǎn)生磷酸基團，促進(jìn)鈣沉積及骨重建[8]。一旦這種狀態(tài)打破，就會導(dǎo)致更多的成骨細(xì)胞破壞，成骨細(xì)胞中的 ALP便釋放到血液中，引起血液中 ALP活性升高。本研究結(jié)果顯示，去勢后大鼠骨組織 ALP mRNA及 ALP蛋白表達(dá)均顯著降低，即二者的降低是同時發(fā)生的;但尚不能推斷血液中 ALP活性升高是成骨細(xì)胞活性增加，進(jìn)而增加了 ALP合成并分泌到血液中所致。因為如果血液中 ALP活性升高時系成骨細(xì)胞分泌增加所致，那么對照組 ALPmRNA表達(dá)理論上應(yīng)低于模型組，而本研究結(jié)果正好相反。因此，有理由認(rèn)為骨質(zhì)疏松的可能機制為雌激素水平降低，導(dǎo)致破骨細(xì)胞的骨吸收增強，成骨細(xì)胞的骨形成活性降低，大量的成骨細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞中的 ALP流失進(jìn)入組織液或血液，引起血液中 ALP活性升高。

骨質(zhì)疏松的發(fā)生是因為骨骼重建的動態(tài)平衡遭到破壞，成骨細(xì)胞大量破壞。而藥物治療骨質(zhì)疏松癥的目的主要是抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成。因此恢復(fù)成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，減少成骨細(xì)胞破壞是治療關(guān)鍵。骨 ALP作為骨形成的重要功能酶之一，并且是骨轉(zhuǎn)換或骨形成的重要標(biāo)志分子;有文獻(xiàn)報道，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在向成骨細(xì)胞分化時，骨組織 ALP變化比其他指標(biāo)更敏感[9];此外亦有報道，藥物治療后血液 ALP恢復(fù)到正常水平[7，10]。結(jié)合本研究結(jié)果，成骨細(xì)胞的骨 ALP主要是細(xì)胞原位表達(dá)，而不是以分泌為主。綜合以上結(jié)果，骨組織ALP水平可作為其他細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的一個鑒定指標(biāo)。本研究的不足之處是未進(jìn)行體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞內(nèi) ALP活性檢測;檢測指標(biāo)單一。上述問題將在以后的實驗中加以解決。

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