溶藻細菌溶藻活性物質的研究進展

魏雅冬，王雙俠，戴 明，王廣慧，張騰霄，李 賀

（綏化學院，黑龍江綏化152061）

隨著社會經濟的快速發展，環境污染日益嚴重。其中最突出的就是含磷工業廢水大量排放，導致藻類過度繁殖，水體富營養化現象加重，水華和赤潮現象不斷發生。藻類大量產生會影響水體的性質，還能使水體環境惡化。進入20世紀以來，我國淡水的水體富營養化現象日益加重，70%的天然淡水湖泊都存在不同程度的富營養化污染現象。因此，去除藻類危害是亟待解決的問題。目前，治理水華和赤潮普遍采用傳統的物理和化學方法，效果不理想且易造成二次污染。細菌溶藻得到了廣泛關注。文獻報道較多的是細菌分泌胞外物質到環境中抑制藻的生長，導致藻細胞溶解[1]。因此通過篩選溶藻細菌來提取其溶藻活性物質成為一個新的研究思路。溶藻細菌的研究在國外已有數十年歷史，最早(1924)發現的溶藻細菌是粘細菌屬(Myxobacter)，隨后國內外一些文獻又有報道如中性檸檬酸菌 (Cltrobacter intermedius)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)等對眾多藻類均有一定的抑制、溶解、毒害或殺傷作用[2]。目前，國內在溶藻細菌及其溶藻活性物質方面的研究剛剛起步。在微生物中細菌的數量占大多數，而且分離研究也比較容易，因此溶藻細菌在治理水體富營養化方面會有廣闊的發展前景。

1 溶藻細菌溶藻活性物質的作用方式

溶藻細菌是指通過直接或間接方式，抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統稱[3]。溶藻細菌對藻細胞的作用方式主要有兩種：一是直接溶藻，即細菌與藻細胞直接接觸或侵入藻細胞使之遭到破壞；二是間接殺藻，主要體現在細菌分泌特殊活性物質抑制藻類生長。后者被認為是細菌溶藻的主要方式。對溶藻細菌作用方式的研究一方面可以知道其作用機理，另外還能對生物殺藻劑的研制有理論指導作用。

2 溶藻細菌溶藻活性物質的種類

溶藻細菌可以通過釋放特異性或非特異性胞外物質，如氨基酸、多肽、蛋白質、抗生素和羥胺等殺死藻細胞。這類細菌常見的有粘細菌（Myxobacter）、弧菌（Vibrio）、假單胞菌（Pseudomonas）、黃桿菌（Flavobacterium）、交替單胞菌（Alteromonas）等。目前報道的細菌溶藻物質主要有以下幾類：

2.1 氨基酸

Yoshikawa[4]從日本一些島采集水樣，篩選具有抗藍藻（Cyanobacteria）活性的細菌。共篩選出2594株細菌，其中僅有37株能分泌抗藍藻（Cyanobacteria）的活性物質。其中一株被鑒定為弧菌（Vibrio）。為進一步驗證其產生的活性物質，將其在海洋肉湯培養基中培養。試驗結果表明：該弧菌（Vibrio）產生的活性物質為β-氰基-L-丙氨酸（L-CNAIa），對細菌和真菌的生長沒有影響，但一定濃度的該物質會影響某些藍藻（Cyanobacteria）的生長。化合物β-氰基-L-丙氨酸（L-CNAIa）可能是影響海洋藻類種群動力學的一個重要因素。

2.2 多肽

Imamura[5]從Biwa湖含微囊藻的水樣中分離出一株鞘氨醇單胞菌（Sporobolomyces），該鞘氨醇單胞菌（Sporobolomyces）釋放的溶藻物質對微囊藻（Microcystis）有強烈殺滅作用。經鑒定，該溶藻物質為五肽argimicinA，分子式為 C32H6N12O8。它在12ug/mL和100ug/mL濃度時分別對綠色微囊藻（Microcystis stiviridsi）和銅綠微囊藻（Microcystis areuginosa）有很強的溶藻活性，對直接從水體中分離的含有細菌的藍藻（Cyanobacteria）亦有很強的溶藻效果。Banin[6]報道了一株珊瑚褪色弧菌（Vibrio shiloi），該菌能合成并分泌一種胞外多肽，被稱為毒素P，該毒素能夠抑制與珊瑚共生的蟲黃藻的光合作用，導致蟲黃藻死亡。

2.3 蛋白質

Lee[7]從海水中分離一株編號為A28的假交替單胞菌（Pesudoaletormonas）。試驗結果表明：該菌能殺滅骨條藻（Skeletonema costatum）。將A28培養一段時間后，取其上清液作溶藻實驗，發現該上清液有很強的殺藻能力。上清液經過高溫處理，結果A28的上清液沒有表現出殺藻活性。進一步試驗檢測表明A28能產生一種胞外絲氨酸蛋白酶殺藻。

Mitsutani[8]報道一株編號為A25的假交替單胞菌（Pesudoaletormonas），用一定濃度的該菌液接種到骨條藻（Skeletonema costatum）培養物中后，2天內就能把骨條藻（Skeletonema costatum）全部溶解。雙向電泳對A25蛋白進行分析，結果表明：A25在菌體生長穩定期能產生大量蛋白質，而在穩定期以后的各時期未檢測到活性物質。把穩定期菌體進行離心，仍然表現出溶藻能力。這些試驗結果表明：A25是通過穩定期分泌的蛋白質活性物質來溶解骨條藻（Skeletonema costatum）的。

2.4 抗生素

Dakhama[9]發現一株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌能釋放低分子量并具有熱抗性的物質。在試驗的藻類中，該菌能強烈抑制藍藻（Cyanobacteria）和綠藻（Chlorophyta）的生長。進一步檢測結果表明：這株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是通過釋放瓊脂擴散性嗪色素抑制宿主藻類的生長。

2.5 羥胺

Paul[10]分離出一株節桿菌（Arthorbacetsrp），屬于硝化細菌。試驗結果表明：該菌的分泌物能強烈抑制小球藻（Chlorella vulgaris）的生長。進一步試驗表明：該菌是通過氧化銨或其它還原性的氮化合物釋放的羥胺抑制小球藻（Chlorella vulgaris）的生長。

2.6 其它溶藻細菌的活性物質

近年來，隨著對溶藻細菌研究的不斷深入，溶藻細菌的溶藻活性物質不斷被報道。多數學者報道的都是溶藻細菌通過分泌胞外物質對宿主藻細胞起到抑制或殺滅的作用。Lovejoy[11]發現一株假交替單胞菌（Pesudoaletormonas）分泌細胞外物質溶藻。Baker[12]發現某種假單胞菌（Pseudomonas）能夠分泌活性物質殺滅硅藻（Thalassiosira pseudonana），這種物質分子量大且對熱不穩定。裴海燕等[13]分離出一株芽抱桿菌（Bacillus），該菌通過釋放溶藻物質溶藻。該溶藻物質耐熱性較好。目前，多數溶藻細菌的活性物質沒有被鑒定，所以它們的作用機制也不是很清楚。

3 溶藻細菌溶藻活性物質的提取和篩選方法

通常情況下，溶藻細菌活性物質的提取是通過檢測培養菌上清液是否具有溶藻活性的方法進行的。即首先通過常規平板法分離篩選細菌，然后用被篩選溶藻細菌培養物上清液進行溶藻試驗，若該上清液有溶藻能力，這就表明該細菌是通過分泌活性物質進行溶藻的。最后再通過理化方法以及分子生物學手段對活性物質進一步鑒定，進而對活性物質作分類，但是這種方法效率比較低。Yoshikawa[4]為了檢驗其所分離細菌的分泌物是否具有溶藻活性，從供試的2594株分離細菌中僅發現37種能產生抗顫藻（Oscillatoria）的物質。這種方法屬于隨機篩選，不僅勞動量大，且試驗周期也較長。為了提高篩選效率，Imamura[2]采用了一種兩步篩選法來篩選抗微囊藻（Microcystis）化合物的效率。首先將通過藻菌液體共同培養篩選出溶藻細菌，然后用無水乙醇提取溶藻細菌的培養物，待培養物室溫干燥后，將其與微囊藻（Microcystis）共培養，從中篩選分泌殺微囊藻（Microcystis）物質的菌株，最后從這些菌株中分離和鑒定殺藻物質。這種方法在很大程度上提高了細菌殺藻物質的篩選效率。

因細菌溶藻活性物質種類較多，特性也有差異，雖然現在也逐步采用分子生物學手段，但仍然有多數溶藻活性物質未被純化和鑒定，這就限制了對其溶藻機理的進一步研究。鑒于此，這就需要人們掌握一定的先進方法和技術手段。

4 溶藻細菌溶藻活性物質的研究展望

溶藻細菌的溶藻活性物質作為開發新型生物殺藻劑的一種新思路，具有重要的理論意義和潛在的應用價值。因此，如何提取、純化和鑒定高效并具有特異性的溶藻活性物質是目前研究的重點。而如何提高溶藻細菌的篩選效率和對溶藻活性物質分子生物學方面的研究將是未來一段時間內要研究的熱點。而采用基因工程手段來構建新型菌株將是溶藻細菌研究領域中最具意義的研究課題。

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