Akirin1基因在肌肉發生中的作用

汪海鵬,原雪瑩,倪 華

(東北農業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

脊椎動物的肌纖維在胚胎期已經形成, 出生后數目不再改變。肌肉生長主要依賴肌衛星細胞的增殖分化而導致現有肌纖維長度和周徑的增加,而不再依賴肌細胞數目的增多即細胞的增生。研究肌肉分化的機制對于了解胚胎發育、細胞增殖與分化具有重要意義。已經公認，脊椎動物生肌過程主要由生肌決定因子家族(MRFs)、心肌細胞增強子2家族(MEF2s)以及肌肉生成抑制素myostat in(MSTN)等調控。其中MRFs與MEF2s二者相互促進并維持其表達，在不同的發育階段促進肌肉分化。MRFs除了調控肌肉生成，還能夠誘導成纖維細胞、脂肪細胞等多種不同來源的細胞向肌肉方向分化。MSTN則作為肌肉生長的抑制子負調節肌肉發生。Aki r in1基因是近年來新發現的受MSTN特異性下調的靶基因。現就國內外對Aki r in1基因的定位與結構、表達與調節、生物學功能等方面的研究進展綜述。

1 Akirin1基因結構及定位

Marshal l等通過比較MSTN敲除的小鼠和野生型小鼠肌肉中mRNA的基因表達差異鑒定出MSTN下游的一個新基因mighty[1]。Goto等研究了果蠅和小鼠的Aki r ins，后統一將mighty命名為Akirin1[2]。Akirin1屬于Akir ins家族，該家族還含有Aki r in2。有研究表明，Aki r in2單核苷酸多態性影響牛肉大理石花紋的含量[3]。小鼠的Aki rin1定位于4D2.D，編碼2271 bp的mRNA，含有576 bp的ORF。牛的Aki rin1位于3號染色體，DNA長12 212 bp，mRNA長3 760 bp，含有578 bp的CDS，編碼193個AA。Akirin1在各個物種間相對保守，但并不與目前已知的任何蛋白具有較高的同源性[4,5]。Akirins含有一個保守的功能性結構域即N末端的核定位信號NLS。Aki rin1蛋白在核中聚集成斑，核周圍和內質網也有分布。Akir in1與核纖層蛋白有著相同的定位，二者一起結合定位在DNA調節區域的基質附著區(MARs)，這種結合可能是Aki rin1調節下游靶基因表達的基礎。Beut ler等證明，Akirin1能與DNA結合蛋白，或者染色質重塑蛋白如HAT(組蛋白乙酰轉移酶)相互作用從而啟動下游基因表達[6]。

2 Akirin1的表達模式

張志強等發現，Aki r in1在仔豬的18種組織中均有分布，且大部分表達水平較高，提示Aki r in1參與豬早期發育[7]。Marshal l等發現Akir in1在小鼠的多種組織中表達，肌肉中的表達相對低于其他組織，如腦、睪丸、肺、腎、腸和肝，表明Aki r in1在體內有著廣泛的作用[1]。成體后的肌肉組織在受到損傷后能夠自我修復并重生，肌衛星細胞(SC)的激活是肌肉重生的關鍵步驟。激活的SC進入細胞周期，然后自我更新或者分化形成肌管。qRT-PCR和Western blot顯示，激活的SC中Aki rin1表達水平比靜止的要高，這表明Aki r in1可能激活SC進而促進肌肉分化。在心臟毒素notexin注射模型和肌肉切割損傷模型的肌肉修復和重生過程中，Aki r in1的表達水平隨重生進程逐漸升高。這些表明，Akir in1的表達上調促進肌肉重生。Akirin1除了在肌肉組織中，還在炎癥細胞如巨噬細胞中表達。Salerno等在小鼠的腹膜和骨髓起源的巨噬細胞中都檢測到Akirin1的表達，表明Akirin1可能參與炎癥反應[8]。

3 Akirin1基因的功能

3.1 Akirin1的過表達能夠促進肌肉分化與再生

Aki r in1在C2C12細胞中的過表達能夠導致細胞周期的提前退出，肌肉分化標志性分子如p21，MyoD，MyoG和MyHC的表達增強，融合指數(肌管中細胞核占總細胞核的比例)較對照組顯著上升，最終形成肥大的肌管。在mdx小鼠(一種肌營養不良的小鼠模型)中過表達Akirin1可以增加肌纖維橫截面積，并形成短粗而肥厚的肌管。HE染色發現相對于野生型mdx小鼠，過表達Akirin1組的脛骨前肌的重量比對照組要重，并且有著更多的肥大的肌纖維，肌纖維形態更健康，也更容易鑒定[1]。另外，通過Van Geisen染色發現，與對照組相比，Akirin1的過表達還降低了肌肉組織的纖維化，肌肉的退行得到了改善。這些結果提示，外源表達Akirin1能夠促進成肌細胞分化。

哺乳動物成體骨骼肌是一個動態的組織，循環發生著損傷和修復。肌肉損傷伴隨一系列的事件發生，如炎癥反應、肌纖維重生、纖維化等。多種生長因子，如IGFs、FGFs、HGFs等參與該過程。肌肉重生時的表達分析表明，Akir in1早在肌肉重生的第2天就開始表達，并且隨著新生肌管的形成表達逐漸升高。這些提示，Aki rin1的表達與肌肉再生過程密切相關。

3.2 參與炎癥反應并增強細胞的趨化遷移能力

肌肉重生包括兩個重要步驟：炎癥應答后的細胞遷移、肌肉重生。在肌肉再生早期，損傷的肌肉能釋放炎癥因子向周圍的炎癥細胞，如中性白細胞、巨噬細胞等提供趨化信息，以濃度梯度誘導炎癥細胞向肌肉損傷處遷移。巨噬細胞主要分泌蛋白水解酶吞噬降解細胞碎片，并分泌炎癥因子以吸引成肌前體細胞遷移至受損位置。另外，還可以通過釋放肌肉再生因子調節肌肉再生。Sun等認為，Akirin1可能與染色質結合來參與NF-κB調控的免疫反應，Akirin1對果蠅S2細胞抵抗革蘭氏陰性菌侵染時產生抗菌肽是必須的[9]。Salerno等發現巨噬細胞也表達Akirin1，過表達Akirin1導致了巨噬細胞的遷移性增加，促使損傷部位的炎癥細胞發揮相應功能。

哺乳動物胚胎期肌肉生成時成肌細胞也一直在遷移。成肌細胞不僅從體節遷移到肢端產生肌肉系統，在肌肉內部也能夠遷移，彼此融合或者和現存的肌管融合[10]。C2C12以及過表達Akirin1的細胞在2%HS+5%CEE(最適化學引誘劑培養基)存在時有著相同的遷移能力。但CEE撤去時，對照組C2C12遷移數顯著減少，而Akirin1過表達細胞系則和CEE存在時遷移效果一樣，表明Akirin1的過表達增強了成肌細胞的趨化運動能力。成肌細胞遷移需要肌動蛋白actin的聚合，actin聚合形成板狀偽足和絲狀偽足以提供趨化運動的動力。Marshal l等認為，在成肌細胞中，Aki r in1通過重塑肌動蛋白細胞骨架，以PI3K依賴的方式形成更有效的板狀偽足，增強巨噬細胞與成肌細胞的趨化作用[1]。

4 Akirin1基因的調節網絡

4.1 Akirin1在轉錄水平受到MSTN的負調節

Marshal l等發現，Aki r in1在小鼠肌肉中的表達相對低于其他組織，如腦、腸和肝等，但肌肉組織中的mRNA水平在MSTN敲除顯著上調，而其他組織中敲除前后未見明顯變化。對Akir in1基因啟動子活性研究發現，MSTN能以劑量依賴的方式抑制Akir in1啟動子的活性。而先經MSTN處理，再向培養體系中添加MSTN的拮抗劑MSTN-ant1后，Akirin1啟動子活性逐漸恢復。這些結果表明，MSTN在轉錄水平上調節Aki r in1基因的表達。MSTN的功能主要通過I型受體ALK5，II型受體ActRIIB和smad2/3這些受體實現。將Akirin1啟動子分別和dnActRIIB、dnALK5受體或者dnSmad2/3這些顯性負突變載體共轉染C2C12細胞，發現外源MSTN并不影響Aki rin1啟動子的活性。Akirin1依然能夠表達，證明MSTN對Akirin1的啟動子活性的調節通過這些下游受體實現[1]。Aki r in1在野生型和MSTN-nul l的小鼠肌肉損傷后的第5天開始上調，此時成肌細胞彼此融合形成新的肌管，或者和現有的肌管融合。隨后Akir in1在終末分化時一直下調，最終肌肉分化完成，SC細胞重新進入靜止期。Aki rin1的這種表達模式與其通過促進融合最終誘導肌管肥大的作用是一致的。同時也說明，在正常的肌肉組織中MSTN參與維持Aki rin1的正常表達，控制肌肉的正常形態。脂多糖處理巨噬細胞后，Akir in1的表達上升，而向培養體系添加重組MSTN蛋白則顯著下調其表達水平，MSTN的拮抗劑MSTN-ant1能夠解除MSTN對Aki rin1的抑制[1]。這些結果表明，Akir in1參與成肌細胞與巨噬細胞的激活并受到MSTN的下調。

4.2 Akirin1調節肌肉發生相關基因的表達

以前認為，MSTN能夠抑制MyoD的表達和活性，控制成肌細胞的增殖速率從而抑制骨骼肌的肥大。MSTN激活smad3信號通路，激活的smad3結合到MyoD啟動子上并抑制MyoD的轉錄進而抑制肌肉分化。除了影響胚胎肌肉發生，MSTN也影響出生后的肌肉發生。最近的研究表明，MSTN和衛星細胞的靜止有關，MSTN缺失后會增加衛星細胞的激活并促進肌肉恢復。Akirin1基因將MSTN的缺失和成肌細胞分化的增強這二者聯系起來。

4.2.1 Akirin1促進MRFs的表達

在C2C12分化過程中，Akirin1的表達峰值出現時間遠早于MyoD，表明Akirin1作用于MyoD的上游。Aki r in1能夠特異性地上調細胞周期調節子如p21和p27，并促進p21、MyoD、MyoG以及MHC的表達，過表達Akirin1的細胞系比對照組更早地退出細胞周期。成熟的肌管能夠表達MHC，并具有多個細胞核，過表達Akirin1使得肌管出現的時間提前，說明Akirin1在肌管融合時的表達與肌肉分化密切相關。MSTN缺失形成的雙肌牛的成肌細胞經誘導形成的肌纖維(DM)比野生型牛成肌細胞形成的肌纖維(NM)表達更高水平的Akirin1，與之相應的是p21、MyoD和MyoG表達水平的升高，其中以p21和MyoD的上升幅度最高，二者的表達峰值在DM中比NM要早。通過RNAi降低Akirin1在C2C12細胞中的表達水平之后MyoD的表達水平也下降，p21和MyoG的表達也隨之降低，表明Aki r in1的降低導致了這些肌肉分化標志性分子的下調，從而減緩了肌肉分化的進程[1]。這些結果說明，Akirin1通過上調MRFs促進肌肉分化。

4.2.2 過表達Akirin1降低了Sca-1與CD34的表達水平

C2C12細胞或成肌細胞分化培養時，仍然有一部分細胞保持靜止，但是能夠自我更新和分化，這部分細胞稱為保留細胞。分子和免疫組化研究顯示，低水平的Aki r in1和靜止的SC相關，而激活的SC則有著高水平的Akir in1表達。Aki r in1能招募更多激活的SC進入分化途徑，過表達Akirin1的C2C12細胞經誘導分化后殘留的SC數量減少，從而形成比正常肥大的肌管。

靜止的保留細胞能夠表達SC的標志性分子Sca-1(干細胞抗原)和CD34，啟動分化后二者蛋白水平開始下降。Epting等認為，Sca-1的表達能夠保持成肌細胞處于緩慢增殖且不分化的狀態以產生保留細胞。Sca-1在肌管中的表達水平低于保留細胞，并且過表達Aki rin1的細胞系中Sca-1的表達水平整體上低于在C2C12對照組，其中肌管中降低了60%～70%，靜止細胞中降低了40%～50%。另外，通過BrdU標記細胞發現，過表達Akir in1的細胞在分化培養時，BrdU陽性細胞立即顯著減少，Akirin1下調Sca-1導致細胞增殖和融合加速，從而促進肌肉分化[11]。

CD34在肌肉中的作用可能是維持一部分細胞不進行分化。Kitzmann等證實了該觀點，保留細胞對CD34的表達是異質的[11]。無論處于增殖狀態還是誘導分化，Aki rin1過表達的細胞中CD34的總體水平一直低于對照組。Akirin1下調CD34使得一部分細胞對融合和分化信號更為敏感，更容易啟動分化。這表明Akirin1可能通過下調Sca-1和CD34這兩個干細胞維持分子有效地促使細胞快速退出細胞周期。

5 結語

哺乳動物的肌肉發生一直受到廣泛關注，相關的研究主要集中在肌纖維形成和肌肉重生的分子機制上。目前認為，肌肉發生主要受到MRFs、MEF2s、MSTN等轉錄因子的調控。其中MSTN在肌肉分化中負調控肌纖維的數量和體積以維持正常機體發育所需。Aki r in1作為新發現的MSTN下游基因，由于能夠顯著促進肌肉分化和重生而受到重視，但是其作用機制尚未完全闡明。未來的研究主要集中于進一步弄清Akir in1的表達模式及是否存在自我調節，Aki r in1在不同細胞中的作用，Akirin1與生長因子之間的關系，Akirin1上下游的轉錄因子以及相互作用機制這些方面。深入研究Aki rin1不僅可以更加透徹地了解肌細胞生長分化及肌肉形成的分子機制，也可以為臨床上肌肉相關疾病的治療提供理論依據。研究Aki r in1的作用和調控機制也能為轉基因動物和分子育種提供理論基礎，為生產上提高動物的產肉量提供分子育種的新標記。

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