ELISA非特異性顯色原因分析

孔莉娜 李北 李燕紅

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)自1971年自問世以來，以其敏感性高、特異性強、操作簡便、安全而廣泛應用于臨床診斷，開創了免疫學診斷的新紀元。但同其他免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究、生產及使用中常常會碰到非特異性問題，本文就在實驗過程中產生的一些非特異性顯色原因及如何采取措施進行消除作一簡要分析。

1 試劑盒特異性因素

1.1 固相載體的選擇 ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板最為常見。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產品的質量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證，評估。

1.2 包被物的純度 在酶聯免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。

1.3 包被抗體的效價 具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。

1.4 封閉 是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被占據的空隙，減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。

2 檢驗標本中含有酶標記物的干擾物

2.1 內源性干擾物 類風濕因子(RF)、黃疸等，類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體，多數為IgM類，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應，從而呈現非特異性顯色。

2.2 外源性干擾物，常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染，標本凝集不全等。溶血標本，紅細胞溶解破裂，釋放Hb，而Hb中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。因此，血液標本在采集處理時應小心，在冰箱中保存不易過久。標本凝集不全時，血清中會殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽性。

3 操作過程中的問題造成假陽性

3.1 加樣 對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差，尤其當稀釋倍數大時，很小的絕對誤差，會導致較大的相對誤差，使陰性(或弱陽性)標本呈陽性(或陰性)。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統處理標本，可較好地避免以上誤差。

3.2 洗滌 在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關健一步，應引起操作者重視。無論是手工操作還是自動化設備操作，得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。

3.3 溫育 每種試劑都有其最佳反應模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應時間長，會造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發，板上應加蓋。

3.4 酶標儀判讀 作為記錄測定結果的儀器，酶標儀的性能穩定與否，決定結果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養，對濾光片要定期校正;其次酶標儀波長設置要正確，最好使用雙波長，一個檢測波長，一個參考波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的干擾。此外，在用酶標儀讀數時最好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。

綜上所述，由于酶聯免疫吸附技術目前在技術上缺乏標準化，盡管目前國際上以及我國有了部分標準血清或參比血清(血清盤)。但由于受方法學及技術條件的限制，在實驗中有時不可避免的會出現一定的非特異性顯色，但我們可以通過注意以上幾個方面把非特異性顯色降至最低限度，從而提高檢測的特異性，得到更準確、可靠的實驗結果。