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代謝組學技術及其在食品鑒別中的應用

2011-08-15 00:51:54陳利利李云志
食品工業科技 2011年12期
關鍵詞:分析研究

陳利利,李云志,李 麗

(安徽農業大學茶與食品科技學院,安徽合肥230036)

代謝組學技術及其在食品鑒別中的應用

陳利利,李云志*,李 麗

(安徽農業大學茶與食品科技學院,安徽合肥230036)

代謝組學作為系統生物學的一支,已被廣泛應用到各個研究領域。主要簡述了代謝組學技術及其在食品質量和產地來源鑒別中的應用,通過分析表明:代謝組學技術在食品質量檢測、食品產地來源鑒別等方面有著很好的應用前景。但在實際應用中仍存有問題,有待進一步深入研究。

代謝組學,食品,質量,產地,鑒別,應用

2 代謝組學的研究平臺

任何完整的代謝組學研究,均需要考慮以下幾個方面:一是樣品的采集、制備;二是分析技術的選擇;三是對所獲得的數據進行分析;四是識別代謝產物;五是建立模型或解釋所隱藏的生物學意義。

2.1 樣品制備

代謝組是基因型和環境共同作用的結果,其作為代謝組學分析研究的對象,構成十分復雜,具有廣泛的化學多樣性。例如擬南芥有約5000種代謝物,而整個植物界的代謝物的種類估計高達20萬[4-5],高等動物代謝組的規模可能更大[6]。而代謝組學力求分析生物系統中所有的代謝產物,因此樣品制備過程中應盡可能地保留和反映總的代謝產物的信息。由于所采用的分析技術不同,樣品制備方法也各異。目前,常用的樣品預處理方法有液相萃取、固相萃取、固相微萃取和微波輔助萃取等。

2.2 分析技術

對樣品預處理后,選擇一種能分析出所有代謝物的技術手段至關重要。然而,由于代謝物組成復雜、含量不一、樣品制備過程的偏差以及檢測設備的量程及通量等問題,現還沒有一種技術可以滿足對所有代謝物進行分析[7]。現在應用較多的技術主要有核磁共振(NMR)、質譜、色譜(液相和氣相)、紅外光譜以及各種技術之間的聯用。

2.2.1 核磁共振技術 NMR技術是基于原子核磁性的一種技術,可以快速定量分析檢測樣品,對樣品不具破壞性,而且對于樣品的制備無太多要求,制備簡便;另外,利用該技術可在短時間內同時獲得樣品中多種組分的弛豫時間曲線圖譜,從而能準確地對樣品進行分析鑒定[8]。目前常使用的NMR有氫譜、碳譜和磷譜,其中1H-NMR是代謝組學的主要分析技術。利用核磁共振技術對樣品進行分析,其分析性能的好壞,不是依據所檢測到的信號數目而定,而是根據所鑒定的代謝物數量。二維核磁共振或多維核磁共振技術的發展與應用,如關聯能譜法、總相光譜等[9],提供了信號與兩個不同的原子核之間關系的信息,從而提高了對代謝物的鑒定[10]。在靈敏度方面,NMR技術不如其他分析技術的靈敏度高,如:紅外光譜、紫外可見吸收光譜[11]等。然而,低溫探頭在NMR技術中的應用,改善了NMR的靈敏度[12]。隨著NMR靈敏度的改進,LC與NMR的聯用也將成為代謝組學主要分析工具。

2.2.2 色譜與質譜的聯用 色譜和質譜之間的聯用,使其既具有了色譜對復雜樣品較強分離能力的特性,又具有質譜高靈敏度、高選擇性以及提供相對分子質量和豐富結構信息的特性。其中LC-MS、GC-MS技術在代謝組學研究中已得到廣泛的應用,而這兩種技術的離子化程序又有所區別。GC-MS儀器采用硬離子方法電離,電子轟擊電離,而LC-MS利用軟離子方法電離(如在氣壓電離、電噴霧電離、大氣壓化學電離)[26]。

氣質聯用現已廣泛應用于生命科學、環保、材料、食品、藥物開發等領域。可有效的分析分子量相對較低的疏水性化合物,如精油、烴類、酯類和極性減弱的代謝衍生物[13]。飛行時間質譜與氣相結合的引進和發展,大大減少復雜混合物的分析時間并且提高了m/z的精度,優化了所有化合物在色譜圖中的鑒定[14]。在研究中,大多數樣品都需要在室溫或升溫的條件下進行衍生化處理,改善分析對象的揮發性、峰形、分離度、穩定性,從而提高檢測的靈敏度。常見的衍生過程有三甲硅烷基化和與重氮甲烷發生反應[15]。但樣品中水分的存在會嚴重影響衍生化產物的結構。雖然充分的樣品干燥可以減少這種干擾,但過多的樣品干燥又會使某些易揮發代謝物損失[16]。并不是所有的化合物都可以用GC-MS技術進行分析,尤其是不耐熱和大分子代謝產物。隨著GC-MS技術的發展,二維氣相色譜質譜(GC-GC -MS)及多維氣相色譜質譜技術的應用,其高峰容量、抗雜質干擾強的特點,大大提高了分離系統的分辨率。

LC與MS的聯用時,能夠集HPLC高分離性能和MS高靈敏度、高專屬性的優點于一體,并且具有提純和制備單一物質的能力[17]。LC-MS不同于GC-MS,它對檢測溫度要求較低,對樣品的揮發性也沒有太高的要求,避免了GC-MS中繁雜的樣品前處理,不需要對樣品進行衍生化處理。最近高效液相色譜/質譜,超高效液相色譜/質譜和親水作用色譜/質譜在代謝組學研究中的分析潛能已得到重視[18-19]。應用LC/MS技術分析代謝產物時,要求必須同時采用保留時間和質荷比二個參數才能準確地標識一個化學成分,無疑增加了 LC/MS譜圖解析工作的難度[20]。并且該技術還沒有得到一個廣泛光譜數據庫的支持,因此,代謝物鑒定的步驟是比GC-MS技術花費的時間要多[21]。在色譜分析方法中,液相具有最小峰容量,這也就意味著混合物中單一代謝產物的峰分辨率降低。除了通過改善柱性能提高了LC在代謝組學中的應用外,二維液相色譜的引入也克服峰了分辨率低的限制[22]。二維液相色譜在代謝組學研究中具有較好的應用前景。

代謝組學研究中,所用的分析技術還有毛細管電泳質譜、傅立葉變換紅外光譜、紅外光譜、紫外可見光譜法等,然而技術各異,各有優缺點,在此不一一詳述。

2.3 數據分析

代謝組學技術對樣品分析后,獲得的是多維數據信息,對于大量多維數據集進行處理、分析和管理需要結合化學計量學工具。根據各種分析手段的特點,對原始譜圖數據進行提取、峰對齊[23]、去噪[24]等處理。然后對這些數據進行分析,解讀數據中蘊藏的生物學意義。代謝組學研究中,數據分析過程應用的技術主要集中在模式識別上。其中應用最廣泛的是主成分分析(PCA),其他的還有非線形映射(Nonlinear Mapping,NLM)、聚類分析(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)等非監督學習方法和SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogy)、偏最小二乘法——顯著分析(PLS-Discriminant Analysis,PLS-DA),ANN(Artificial neural network)等有監督學習方法。無監督分析方法不能忽略組內誤差,消除與研究目的無關的隨機誤差,過分關注于細節,忽略了整體和規律,最終不利于發現組間差異和差異化合物,而這一點恰恰是代謝組學研究最重要的目的,這個問題卻可以通過采用有監督分析的方法加以解決[25]。

3 代謝組學的應用

代謝組學自出現以來,即引起各國研究人員的注意,現已廣泛的應用于各個研究領域:植物繁育和作物質量的評估,食品安全評估,毒性評估,營養評估,疾病診斷和病情程度的判別,藥物的毒性評價,發酵與作物產量的改進,生物標記分子的發現,分析化學技術的發展,基因分型,環境調適,基因功能的解釋與系統生物整合。

3.1 代謝組學在食品品質鑒別中的應用

民以食為天,食以安為先。食品的質量問題直接關系到人的身體健康、切身利益乃至生命安全。現如今,類似于鮮乳中加入水分、淀粉等物質的摻假行為已屢見不鮮。對食品進行質量鑒定是有必要的。Christy[27]等用近紅外光譜結合主成分分析和偏最小二乘法鑒別了摻入豆油、向日葵油、玉米油、核桃油、榛子油的偽劣橄欖油,結果表明:偏最小二乘校正方法建立的模型可預測橄欖油中摻入玉米油、向日葵油、豆油、核桃油、榛子油的誤差分別為0.57、1.32、0.96、0.56和0.57。另外,利用 PCA建立的模型,幾乎能100%的區分出橄欖油中是否有摻雜。Andreotti[28]等人利用13C-NMR以牛奶中脂肪酸的含量作為鑒別的特征成分,分析了15個不同的樣品。研究表明,核磁共振可以安全地用于定量牛奶脂肪含量,并成功地鑒別了奶牛奶和水牛奶。近幾年利用代謝組學技術鑒定茶葉質量的研究也不少,如Jumtee[29]等利用快速 GC-FID,Pongsuwan[30]等利用GC-MS,Tarachiwin[31]等利用1H-NMR,Ikeda[32]等利用傅立葉變換近紅外光譜,Pongsuwan[33]等利用UPLC-MS都結合化學計量學方法對日本綠茶進行了分析,都可以成功對綠茶進行質量等級鑒別,并識別出影響茶葉質量的特征性化合物。其中核磁共振技術提供了對茶葉質量鑒別的詳細信息,并且樣品制備簡單、分析時間短。此外,利用核磁共振技術,可在單一的運行過程中識別出所有的代謝物。并且Pongsuwan和Tarachiwin在沒有標準品的情況下可對綠茶的等級進行準確劃分,這不同于其他的研究中以某些具體關鍵的代謝產物作為分析目標。Lee[34]等利用1H-NMR結合主成分分析(PCA)分析了產于亞州的人參和美國的西洋參,成功地鑒別了人參的質量,并表明:一些化合物如葡萄糖、富馬酸及各種氨基酸可以作為人參質量鑒別的生物標志物。

3.2 代謝組學在食品產地鑒別中的應用

具有地方特征的產品越來越受廣大消費者的歡迎,這些產品除具有優質品質外,還具有地方特色。產品的質量除受品種的影響外,還受到生長環境(土壤、氣候)、耕作方法的影響。判斷用來釀酒的葡萄質量的傳統方法是分別測定其糖分、酸度、pH和總酚含量。而Pereira[35]等利用傳統質量標準與葡萄果皮和果肉提取液的1H-NMR圖譜建立了波爾多4個不同葡萄酒產區成熟葡萄的代謝物指紋圖譜。通過PCA對傳統質量標準和1H-NMR數據分別進行分析,結果表明4個產區的葡萄有著明顯的聚類。尤其1H-NMR可以通過已識別和一些暫時無法識別的代謝物成分進行代謝物指紋分析,而傳統方法無法做到這一點。陳波[36]等用1H-NMR分析測定了35種從福建、云南、廣州、江西等地采集及購買的不同種類的茶葉。檢測出約20種物質,包括多種氨基酸、茶氨酸、多種兒茶素(EGC、EC(兒茶素)、EGCG、ECG和一些未知的兒茶素)、蔗糖、未知糖類、脂肪酸、咖啡因等。所得譜圖經主成分分析,實現了不同種類的茶葉以及鐵觀音產地的區分,并且發現了引起區分的化學成分:紅茶和黑茶與綠茶和烏龍茶相比,部分氨基酸和一些未知成分的含量較高,而兒茶素的含量較低;安溪西坪鐵觀音與安溪祥華和感德鐵觀音相比,部分氨基酸、咖啡因、EGCG、ECG以及一些未知成分的含量較高,而EC、EGC含量相對低。另外,譜圖的聚類分析也顯示了與主成分分析類似的結果。Ritota M[37]等用帶有HRMAS探頭的核磁共振結合多變量分析方法對意大利甜辣椒的代謝物進行了分析。HRMAS-NMR光譜對甜辣椒進行代謝指紋分析,利用PLS-DA建立的模型可以將兩種甜辣椒明顯區分開來,并且確定了引起兩者之間區分的化合物是糖、有機酸和脂肪酸。另外,用PLS-DA對所獲得的NMR數據分析,可根據其地理來源將甜辣椒明顯的區分開。此外也說明了,在食品科學領域HRMAS-NMR是一互補的標準分析工具。Kang[38]等運用GC-MS和LC-MS結合多變量分析方法研究了樹蔭下生長的綠茶與正常生長的綠茶之間代謝物的差異。研究表明,茶樹生長的環境對其化學成分的組成有影響,并發現了區分樹蔭下生長的茶樹的生物標志物。此外,在樹蔭下生長的茶樹所產的茶葉鮮味濃,少了茶的澀味。由此也說明了生長環境對植物的化學成分是有所影響的。

3.3 代謝組學在轉基因食品中的應用

為了使農作物具有耐貯藏、抗病蟲和抗除草劑的能力,提高農產品營養價值及更快,更高效的提高產量,科學家們應用轉基因的方法,改變生物的遺傳信息,生產了新的轉基因食品。目前,對于轉基因食品的質量以及對人類健康的影響仍有質疑。Gall G.Le[39]等利用1H-NMR對紅番茄基因改良后潛在的非預見變異作用進行檢測。比較了在同等條件下生長的不同成熟程度的基因改良和無基因改良番茄的代謝物成分。1H-NMR圖譜顯示:谷氨酸、果糖和一些核苷及核苷酸的含量隨著番茄從不成熟到成熟逐漸增加,而一些氨基酸如纈氨酸和γ-氨基丁酸的含量則逐漸降低。經比較,兩種紅番茄除了6種主要黃酮苷外,至少有15種其它代謝成分含量不同。將PCA與PLS應用于80份兩種番茄的1H-NMR數據,幾乎可完全實現區分。這項研究清楚地表明,核磁共振結合化學計量學和一元統計學方法可以成功地鑒別基因改良和無基因改良食品代謝物成分之間的差異,即使是很微小的變化。用這個強大的工具分析轉基因食品潛在的變化,可以檢測其質量及對人類健康的影響。代謝組學技術也已應用到轉基因土豆[40]、轉基因玉米[41]等食物的代謝成分分析。

4 展望

為了保證食品質量、保障消費者利益,對食品進行質量鑒定和產地來源鑒別的重要性是顯而易見的。目前,已有不少分析技術應用到食品品質鑒定中,而代謝組學最顯著的特征在于它的整體分析能力,更強調外源性物質對生物體所產生的整體性效應。可以更好的反應環境(地理、氣候等)對食品組成成分的影響。代謝組學從1999年左右興起,受到各國研究人員的關注,但它并沒有像蛋白質組學那樣出現迅速趨熱的現象,而是呈現出了一種緩慢上升的趨勢。在我國,該領域的研究起步比較晚,但代謝組學仍屬于一種技術潛力尚待開發的新興學科領域,我國有待在該研究領域與國際接軌。目前僅有一部分代謝產物已得到識別,仍有相當大的一部分代謝產物未被鑒定,這也成了代謝組學發展的障礙。在代謝組學的研究過程中,建立大規模的標準化代謝組學數據庫仍是一個重要的問題。

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Metabolomics technology and its application in food identification

CHEN Li-li,LI Yun-zhi*,LI-Li
(College of Tea and Food and Science Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Metabolomics which as one of the systems biology has been widely applied to various fields of study. Primarily briefly outlined the metabonomics technology and the application of metabonlmics technology in food quality and identification of food origin.The analysis showed that:metabonomics had favorable the applying prospects in the valuation of food quality,the identification of food origin and so on.However,there were many problems in practice,which needed to be further in-depth study.

metabolomics;food;quality;geographic origin;valuation;application

TS201.2

A

1002-0306(2011)12-0585-05

梁斌的《播火記》中曾記載:“一方水土養一方人”,而對于萬物也亦如此。我國幅員遼闊,地形復雜,氣候多樣,各地特有的自然地理條件,形成了很多具有典型特征的地域;然而受地域、生長環境、氣候、人文等方面的影響,加之當地獨特的加工工藝,形成了許多具有典型地域特征的農業土特產品,如安徽的黃山毛峰、貴州的茅臺酒、鎮江香醋等。這些產品的質量、特色、聲譽在全國乃至世界上都占有較高的地位。眾所周知,產品的質量和原材料的產地來源是消費者購買產品的兩大主要參考因素,這兩方面保證了產品具有一定的質量。然而,在食品工業生產中,假冒名優產品原產地、食品中摻雜其他成分等不法銷售的現象屢見不鮮。這不僅破壞了優質產品的聲譽,而且侵害了消費者的利益。為了保障消費者的合法權益、企業的公平競爭不受侵害以及提高產品的外銷量,近年來越來越多的分析技術應用到食品品質和產地鑒別中。本文主要綜述了代謝組學技術及其在食品品質和產地鑒別方面的應用。

1 代謝組學概述

1999年,英國倫敦大學帝國學院的 Jeremy Nicholson[1]教授首次提出了代謝物組學一詞。他是效仿基因組學、蛋白質組學的研究思想,對生物體的代謝產物進行定性定量分析,其分析研究的對象是相對分子質量1000以內的小分子代謝產物。根據研究的對象和目的不同,Oliver Fichn[2]對生物體系的代謝產物分析劃分為4個層次:一是代謝物靶標分析(Metabolite target analysis):某個或某幾個特定組分的分析;二是代謝輪廓分析(Metabolic profiling analysis):少數預設的一些代謝產物的定量分析。如某一類結構、性質相關的化合物(氨基酸、有機酸、順二醇類)或某一代謝途徑的所有中間產物或多條代謝途徑的標志性組分;三是代謝組學(Metabonomics):限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分的定性和定量;四是代謝物指紋分析(Metabolic fingerprinting analysis):不分離鑒定具體單一組分,而是對樣品進行快速分類。目前國際上對代謝組學有兩種表達方式,即:Metabolomics和Metabonomics。兩者既有區別又相互聯系,Fiehn[3]等認為Metabolomics是Metabonomics的組成部分。目前,在國內將Metabolomics譯成“代謝物組學”,而把Metabonomics譯成“代謝組學”。但是,隨著學科的進一步發展和不斷深入的討論,代謝物組學和代謝組學應該有可能會出現融合的現象。

2010-10-27 *通訊聯系人

陳利利(1985-),女,碩士研究生,研究方向:營養與食品衛生。

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