MAPK信號(hào)通路研究進(jìn)展

陳建勇 王聰 王娟 曹禮榮

（湖北中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖北荊州434020）

細(xì)胞對環(huán)境變化的反應(yīng)部分是由一系列胞內(nèi)信號(hào)途徑來誘導(dǎo)的，信號(hào)通路接替、放大并整合來自胞外刺激的信號(hào)，最終導(dǎo)致基因和生理的改變。MAPKs是眾多信號(hào)蛋白的一種，其激活調(diào)控一系列細(xì)胞活動(dòng)。活化的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

1 MAPK信號(hào)通路概述

MAPK是哺乳動(dòng)物內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，可以被一系列的細(xì)胞外信號(hào)或刺激所激活，如物理應(yīng)激、炎性細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)菌復(fù)合物等。MAPKs是一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的成分，是多種胞外刺激的關(guān)鍵因素，能夠調(diào)節(jié)基本的細(xì)胞過程。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是以三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)的方式進(jìn)行的，首先MAPKKK受有絲分裂原刺激磷酸化而激活，在此基礎(chǔ)上MAPKKK轉(zhuǎn)而磷酸化激活MAPKK，最后由MAPKK磷酸化MAPK，使其活化進(jìn)而轉(zhuǎn)入核內(nèi)。

MAPK家族的信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶（ERK）、c-Jun N端激酶（JNK）/應(yīng)激激活的蛋白激酶（SAPK）、P38MAPK以及ERK5/BMK1四條途徑。ERK、JNK、P38、ERK5/ BMK1可以由不同的刺激因素激活，形成不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活各不相同的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)，但這幾條通路存在廣泛的“cross talk”，從而導(dǎo)致通路間產(chǎn)生相互協(xié)同或抑制作用。有研究證實(shí)F.ularensis LVS感染會(huì)影響細(xì)胞生長和存活，感染導(dǎo)致鼠巨噬細(xì)胞的凋亡需要ERK1/2MAPK參與。其中PIASxa是決定轉(zhuǎn)錄因子ElK-1對ERK和P38MAPK通路作出不同反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)子。ERK1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059和U0126也能阻斷ERK5的活性。有報(bào)道，V12 H-Ras是一種H-Ras組成性活化形式，能夠激活BMK1，且不是通過活化Raf1。這些都表明，在腫瘤產(chǎn)生的某些細(xì)胞中，ERK1/2和BMK1通路間的對話可能是通過兩條通路的上游信號(hào)分子，比如Raf1和H-Ras。

2 MAPK信號(hào)通路主要途徑

2.1 Ras-Raf-ERK途徑

在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各通路中，Ras通路是迄今研究得比較清楚的一條通路，該通路參與了細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖、分化等多種生理、病理過程。生長因子與受體結(jié)合激活酪氨酸激酶，通過銜接蛋白將信號(hào)傳遞給Ras蛋白，Ras-GTP直接與Raf相結(jié)合，形成一個(gè)短暫的膜錨定信號(hào)。活化的Raf通過磷酸化促分裂原激活的蛋白激酶的激酶（MEK）環(huán)上的絲氨酸殘基而將其激活。MEK再將促分裂原激活的蛋白激酶（ERK）激活，進(jìn)而磷酸化許多與胞質(zhì)和胞膜相連的底物。ERK還可被快速地轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核去磷酸化和激活A(yù)P-1、ELK-1、SAP等涉及增殖反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄分子，促進(jìn)細(xì)胞增殖[1]。

2.2 JNK途徑

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）家族是1990年被發(fā)現(xiàn)的促M(fèi)APK超家族成員之一，屬于進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。以JNK為中心的信號(hào)通路可被細(xì)胞因子、生長因子、應(yīng)激（如電離輻射、滲透壓、熱休克和氧化損傷）等多種因素激活，引起MAP3Ks活化，然后激活MAP2K異構(gòu)體MKK4和MKK7，然后磷酸化JNK[2]。大量實(shí)驗(yàn)提示JNK信號(hào)通路在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及多種疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，因此JNK信號(hào)通路是正常與疾病狀態(tài)時(shí)細(xì)胞的一個(gè)重要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

JNK最初被發(fā)現(xiàn)是一種特異性磷酸化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的激酶，并因此被命名為c-Jun氨基末端激酶，隨后發(fā)現(xiàn)其他一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子也是其下游底物，但一直對JNK的胞漿底物知之甚少。近年來一些研究顯示胞漿中的某些成分（如細(xì)胞骨架蛋白）可能也是其作用的底物。活化的JNK可以和轉(zhuǎn)錄因子ATF2及c-Jun的氨基末端區(qū)域結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子的活性區(qū)域發(fā)生磷酸化。他們又以同二聚體或異二聚體的形式和許多基因啟動(dòng)子上的AP-1（activator protein-1）和AP-1樣位點(diǎn)結(jié)合，提高AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成。

許多研究證明JNK信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。在某些類型的細(xì)胞中，JNK和（或）p38的激活促進(jìn)炎癥、細(xì)胞凋亡。基因敲除鼠的研究表明MAPK磷酸酶（MKP）在JNK信號(hào)通路中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。用反應(yīng)性氧核素來抑制MKP活性可以延長JNK的活化[3]。事實(shí)上，MKP抑制可能在某些刺激之后足以讓JNK激活。對MKP5結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究磷酸化導(dǎo)致的JNK失活機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

目前很多研究已經(jīng)關(guān)注JNK在2型糖尿病中的作用，最近有研究也確定了JNK在1型糖尿病中的作用。有數(shù)據(jù)顯示JNK參與了bFGF介導(dǎo)的表面鈣黏素的下調(diào)，表面鈣黏素的缺失可能影響內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用，可能還會(huì)促進(jìn)血管生成[4]。研究表明A.otitidis激活NF-kB、p38 MAPK、ERK1/2途徑導(dǎo)致IL-8的生成。對這些信號(hào)通路進(jìn)一步的研究有助于我們理解A.otitidis的免疫刺激作用和其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中重要的分子和細(xì)胞機(jī)制。JNK可能有利于疾病治療新方法的發(fā)展，需要進(jìn)一步的研究來確定JNK在疾病發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。

2.3 p38 MAPK途徑

p38是由360個(gè)氨基酸殘基組成的相對分子質(zhì)量為38000的蛋白，與JNK同屬SAPK。p38 MAPK可以由細(xì)胞外的多種應(yīng)激包括紫外線、放射線、熱休克、促炎因子、特定抗原及其他應(yīng)激反應(yīng)活化，在凋亡、細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及細(xì)胞骨架識(shí)別中起重要作用。

p38 MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括4種激酶：PAK（p21 activated kinase，MAPKKKK）、MLK（MAPKKK、MKKK或MEKK）、MKK3/6/4（MAPKK、MKK或MEK）、p38 MAPK（MAPK），它們構(gòu)成了一個(gè)連續(xù)的蛋白激酶反應(yīng)鏈。細(xì)胞外信號(hào)與受體特異性結(jié)合后，通過磷酸化PAK和MLK（主要為MLK3），促進(jìn)MKK3/MKK6基因表達(dá)，并使其表達(dá)蛋白磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)p38 MAPK基因轉(zhuǎn)錄，提高其生物功能，活化的p38 MAPK通過上調(diào)某些轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)和生物活性，影響細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞因子的合成[5]。p38信號(hào)通路控制多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)活性，如激活作用轉(zhuǎn)錄因子、生長停滯及DNA損傷基因、核因子-KB、熱休克轉(zhuǎn)錄因子等[6]，其中，有些轉(zhuǎn)錄因子是p38直接底物，而有些是p38間接底物。p38 MAPK可影響多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，用LPS刺激大鼠巨噬細(xì)胞后，可致巨噬細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK的磷酸化，抑制這一步磷酸化可減輕甚至完全阻斷巨噬細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的產(chǎn)生，說明炎性反應(yīng)中TNF-α的產(chǎn)生與p38 MAPK激活密切相關(guān)。

氧化應(yīng)激通過激活p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游daf-16來介導(dǎo)DAF-16的調(diào)節(jié)，使DAF-16進(jìn)入胞核并且激活轉(zhuǎn)錄[7]。有研究表明氯喹抑制了p38的活化，SB203580（p38抑制劑）抑制病毒復(fù)制，這都提示氯喹可以通過抑制p38的活化來抑制病毒復(fù)制[8]。

3 ERK5/BMK1途徑

ERK5通路是一種非典型的MAPK通路，也叫做大MAPK通路（Big MAPK/BMK1），可以被各種刺激因素激活，包括一些有絲分裂原、EGF、NGF、VEGF、FGF2、BDNF、溶血磷脂酸、佛波酯和一些細(xì)胞應(yīng)激，例如氧化、紫外照射和滲透壓干擾。ERK5與ERK1和ERK2存在著序列同源性，他有著與ERK1/2相似的蘇氨酸、酪氨酸TEY磷酸模序。ERK5分子量較大，約為100kda，還有一個(gè)大的羧基端和12環(huán)結(jié)構(gòu)，羧基端包含有一個(gè)核定位信號(hào)（NLS）和脯氨酸富集區(qū)。NLS有利于BMK1刺激后核定位，脯氨酸富集區(qū)則作為與帶有SH3結(jié)合模序蛋白相互作用位點(diǎn)。這些特點(diǎn)都將其與ERK1/2等其他MAPK家族成員區(qū)分開來。

ERK5在MAPK家族中是一個(gè)獨(dú)特的激酶，它不僅通過磷酸化作用使底物活化，并且通過C端的物理性結(jié)合作用激活底物。各種刺激因素激活MAPKKK（MEKK3或MEKK2），依次激活MAPKK（MKK5），然后激活ERK5，這就是ERK5通路的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。同其他的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路一樣，ERK5對于細(xì)胞生存、增殖和分化起著極其重要的作用。近年來通過敲除鼠BMK1的基因或者BMK1通路中的一些信號(hào)分子的研究揭示BMK1信號(hào)通路在血管生成、心臟發(fā)展、血管完整性維持中都有重要作用[9]。

BMK1在胚胎血管生成和在成年鼠體內(nèi)維持血管形成也是必需的，但是突變胚胎和BMK1敲除的成年鼠在死亡前的較長時(shí)間仍然有血管網(wǎng)絡(luò)存在，這又表明缺乏BMK1的內(nèi)皮細(xì)胞可能還有血管相應(yīng)潛能。免疫熒光比較BMK1敲除鼠和對照組的血管系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞中BMK1和磷酸化rpS6的出現(xiàn)有密切聯(lián)系[10]。同時(shí)也有研究表明，在腫瘤異種移植的鼠模型中可以看到，消除宿主BMK1基因可以抑制腫瘤血管發(fā)展，并且相應(yīng)能阻斷外源性腫瘤的生長，這些都顯示，BMK1通路在腫瘤相關(guān)的血管生成中有主要作用[10]，可能是通過對內(nèi)皮細(xì)胞rpS6磷酸化發(fā)揮作用。

BMK1信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)癌基因信號(hào)，對于一些腫瘤失控性生長有重要作用，并且能夠提高腫瘤細(xì)胞化療效果。前列腺癌的預(yù)后差和骨轉(zhuǎn)移歸因于BMK1活性上調(diào)[11]。對化療耐受的乳腺癌細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)MEK5的過度表達(dá)。Weldon等證實(shí)能夠耐受凋亡的MCF-7細(xì)胞株中MEK5的mRNA水平比凋亡敏感的細(xì)胞株要多出20倍。用BMK1的顯性負(fù)相形式阻斷凋亡耐受細(xì)胞中的BMK1通路，可以逆轉(zhuǎn)化療耐受并且能夠增加治療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，這種現(xiàn)象表明BMK1信號(hào)通路能夠傳遞抗凋亡信息是乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐受。相關(guān)實(shí)驗(yàn)也提出BMK1可以通過增加HIF1α遍在蛋白化和抑制內(nèi)皮細(xì)胞中HIF1α活性，來對HIF1α和血管生成起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[12]。

近來也有研究表明BMK1在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中的重要作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMK1還在一些血管疾病比如動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮作用[13]。BMK1缺失鼠在胚胎10d左右就會(huì)死去，主要是因?yàn)樾难苋毕輀14]。這些鼠有血管生成，但是無法發(fā)育成熟。BMK1通路參與了心臟肥厚，這是為了增加心臟功能而出現(xiàn)的一種適應(yīng)性反應(yīng)[15]。

Jane E.Cavanaugh研究發(fā)現(xiàn)ERK5有神經(jīng)營養(yǎng)因子介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，使PC12和原代神經(jīng)元免于PNS和CNS。這種神經(jīng)保護(hù)機(jī)制部分是由于轉(zhuǎn)錄因子CREB、MEF2C還有MEF2A的活化來介導(dǎo)的，然而還需要更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。也有數(shù)據(jù)表明，ERK5通路的活化可能參與細(xì)胞死亡。通過ERK1/2持續(xù)的活化促進(jìn)了氧化性神經(jīng)細(xì)胞死亡，并且通過Bcl2磷酸化和后續(xù)Bax易位的增加參與介導(dǎo)中腦神經(jīng)細(xì)胞死亡，這些研究中利用MEK1抑制劑抑制MEK5以阻斷ERK5通路。因此，要進(jìn)一步深入研究ERK5活化的動(dòng)力學(xué)、活化后的亞細(xì)胞定位等來確定ERK5在神經(jīng)細(xì)胞死亡中的可能機(jī)制。通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)高葡萄糖濃度可以激活ERK5活性，從而表明了ERK5通路可以被高滲透壓刺激因素激活，并且提出ERK5誘導(dǎo)的腎小球膜細(xì)胞增殖可能是糖尿病腎病綜合征的致病因素之一[16]。

ERK5是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相對較新的一條通路，此通路與疾病之間的關(guān)系還有待研究。已有實(shí)驗(yàn)表明MEK5-ERK5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制可能有助于提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[17]，但如何調(diào)控ERK5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使其發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤凋亡和克服腫瘤耐藥的作用并應(yīng)用于臨床還需要更多的努力。

4 信號(hào)通路研究方法

20世紀(jì)90年代以來，對細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究逐漸成為國內(nèi)外生物學(xué)界廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來有關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的方法層出不窮，如RNA干擾技術(shù)、抗體免疫沉淀、32P標(biāo)記結(jié)合蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）等，來檢測和鑒定信號(hào)傳遞過程中差異表達(dá)的信號(hào)分子及關(guān)鍵蛋白的磷酸化。隨著雙向電泳（two dimensional electrophoresis，2-DE）和質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，蛋白質(zhì)組學(xué)方法越來越多地被用于研究胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足之處，實(shí)現(xiàn)了高通量大規(guī)模的研究模式，在蛋白質(zhì)水平上了解細(xì)胞的各項(xiàng)功能、各種生理生化過程以及疾病的病理過程等[18]，為我們完整地繪制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)圖提供了更為可靠的依據(jù)。

蛋白質(zhì)組學(xué)是對基因組編碼的所有蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)組進(jìn)行大規(guī)模研究的一門科學(xué)。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究蛋白質(zhì)復(fù)合物及信號(hào)傳導(dǎo)通路可以為理解蛋白質(zhì)是如何相互作用形成細(xì)胞工廠提供更好的路線。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究，主要在對蛋白表達(dá)譜的檢測和定量、翻譯后修飾的識(shí)別，以及蛋白質(zhì)之間相互作用圖譜的繪制等方面。蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白質(zhì)水平上分析導(dǎo)致疾病的蛋白質(zhì)變化，確定分子標(biāo)記以供診斷，了解疾病發(fā)生的不同過程、同一病征的患者不同的病因，以及疾病與年齡、疾病的組織特異性等問題[19]。在應(yīng)用研究方面，蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一。

5 展望

雖然不同的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)有很大區(qū)別，功能獨(dú)立，但在這些通路之間也有所交匯。由于信號(hào)的傳遞在細(xì)胞的增殖、分化和生存等過程中都起著十分關(guān)鍵的作用，因而逐漸成為解決許多重要理論及實(shí)踐問題的基本思路和有力武器。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也與一些病理過程密切相關(guān)，以信號(hào)通路作為靶點(diǎn)進(jìn)行疾病治療是目前生物界熱點(diǎn)。深入探討MAPKs信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)、相互調(diào)控的機(jī)制，將為生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞性狀、功能改變的調(diào)控機(jī)制提供新認(rèn)識(shí)。對于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的反應(yīng)分子、作用底物、作用機(jī)制及調(diào)控機(jī)制仍然有待進(jìn)一步深入的研究。信號(hào)通路的研究為醫(yī)藥研究、疾病治療提供了廣闊的發(fā)展前景，具有重要理論和實(shí)踐意義。

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