牦牛新孢子蟲病ELISA檢測

鐵富萍，李德壽，李 娟

（青海省海晏縣畜牧獸醫(yī)站，海晏 812200）

牦牛新孢子蟲病ELISA檢測

鐵富萍，李德壽，李 娟

（青海省海晏縣畜牧獸醫(yī)站，海晏 812200）

牛新孢子蟲病是由犬新孢子蟲（Neospora caninum）寄生于犬、牛、綿羊、山羊、馬等動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、肝及其他內(nèi)臟引起的一種原蟲病，可使孕畜發(fā)生流產(chǎn)或死胎，新生胎兒發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)和運動障礙等［1-3］。犬和郊狼是其終末宿主。新孢子蟲隸屬頂復(fù)門、孢子蟲綱、真球蟲目，現(xiàn)已廣泛分布于北美、歐洲、澳大利亞和新西蘭等國家或地區(qū)，在羊、山羊、鹿、犀牛和馬上廣泛流行，且在水牛、紅狐、灰狐、北美草原小狼、駱駝和貓科動物中已經(jīng)報道發(fā)現(xiàn)了N.caninum血清抗體。新孢子蟲對牛的危害主要是妊娠母牛流產(chǎn)或產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎，從而造成乳牛或肉牛的生產(chǎn)性能降低而被淘汰［4］，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。為明確青海省海晏縣牦牛新孢子蟲病感染情況，筆者等于2009年8月，對海晏縣牦牛進(jìn)行N.caninum抗體檢測，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 犬新孢子蟲重組蛋白GST-NcSAG1t，在前期研究中進(jìn)行了克隆、表達(dá)和純化；陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清，均為日本國家原蟲中心玄學(xué)南博士惠贈，由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)所生物技術(shù)研究室保存；其他試劑均購自國內(nèi)或Sigma公司。

1.2 被檢血清的采集與處理 135份被檢血清均采自青海省海晏縣自然放牧的牦牛群，均空腹、頸靜脈采血，采集后擺成斜面，置4℃冰箱5 h后，室溫下析出并收集血清，-20℃冷凍保存待檢。

1.3 ELISA檢測步驟

1.3.1 抗原的包被

按5 μg/mL劑量將抗原GST-NcSAG1t和GST加入包被液中（50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.6），混勻后注入96孔平底微量板（Nunc，Denmark），每孔50μL，4℃培養(yǎng)過夜。

1.3.2 封阻 用含有0.05%Tween-20的PBS沖洗1次后，殘留的粘附物用含3%脫脂乳的封阻液進(jìn)行封阻，每孔 100 μL，37℃培養(yǎng) 1 h。

1.3.3 加樣 用沖洗液沖洗微量板1次，在封阻液中按1∶100滴度稀釋被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的兩個孔中，每孔 50 μL，37 ℃培養(yǎng) 1 h。

1.3.4 加二抗 用沖洗液沖洗6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀釋辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗牛IgG抗體（BethylLaboratories，USA），后每孔加入50μL，37℃培養(yǎng)1h。

1.3.5 底物 用沖洗液沖洗6次后，每孔加入底物100μL，每毫升底物中含0.3 mg的2，21azino bis（3 ethylbenz thia zoline 6 sulfonic acid）、0.1 mol的檸檬酸、0.2 mol的磷酸緩沖液和0.003%H2O2，每孔加入量為100 μL。

1.3.6 測定 用Wellscan MK 3酶標(biāo)讀數(shù)儀（Labsystems Dragon，F(xiàn)inland）在415 nm條件下測定光吸收值。

1.3.7 判定標(biāo)準(zhǔn) 用最大稀釋度的倒數(shù)表示ELISA滴度，抗原GST-NcSAG1t孔和GST孔之間光密度吸收值之差作為該被檢樣品的光密度吸收值。兩孔陽性血清對照孔的平均值須大于0.1；兩孔陰性血清對照孔的平均值須低于0.1；兩孔待檢樣品的平均值等于或大于0.1為陽性，低于0.1為陰性。

2 結(jié)果

結(jié)果表明，所檢測的135份被檢牦牛血清中，共檢出N.caninum抗體陽性血清5份，陽性率3.7%。

3 討論

3.1 本次共檢測海晏縣牦牛血清135份，檢出N.caninum抗體陽性血清5份，陽性率3.7%，表明海晏縣牦牛群中存在N.caninum感染，但該感染率低于馬利青等［5］報道的青海省牦牛N.caninum的感染率11.6%（21/181）和晁萬鼎等［6］報道青海省格爾木市乳牛N.caninum的感染率 11.42%（4/35）。

3.2 由于N.caninum的表面抗原NcSAGl與T.gondii的SAGl在遺傳上同源，兩者之間具有交叉反應(yīng)，因此一些學(xué)者認(rèn)為在使用SAGl時易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，但大量的實驗數(shù)據(jù)證明，用SAGl作為ELISA診斷抗原檢測T.gondii人工感染鼠時，未發(fā)生交叉反應(yīng)。另外的研究也證實，用重組的T.gondiiSAGl作為ELISA診斷抗原檢測N.caninum人工感染鼠時也不發(fā)生交叉反應(yīng)，故認(rèn)為NcSAGl是檢測動物N.caninum感染的重要診斷抗原之一。該試驗進(jìn)一步證實，重組蛋白NcSAGlt作為ELISA診斷抗原，具有靈敏性、特異性等特點，為今后開展該領(lǐng)域流行病學(xué)調(diào)查奠定了堅實的基礎(chǔ)。

3.3 預(yù)防牦牛新孢子蟲病，需加強(qiáng)檢疫工作，防止和杜絕引進(jìn)帶病牛，定期進(jìn)行血清學(xué)檢測，檢出陽性者及時淘汰或治療，防止犬糞污染草場、飲水和飼料，草場圈舍要定期消毒。禁用可能感染的內(nèi)臟喂犬，加強(qiáng)滅鼠工作。

致謝：在檢測過程中得到青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院馬利青和蔡其剛老師的指導(dǎo)，特此致謝。

［1］楊光友.動物原蟲學(xué)［M］.成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，295.

［2］馬少麗，馬利青.絨山羊犬新孢子蟲病的血清學(xué)調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，42（9）：25-26.

［3］馬利青.柴達(dá)木地區(qū)黃牛新孢子蟲病的ELISA檢測［J］.畜牧與獸醫(yī)，2006，38（4）：46-47.

［4］于晉海，劉群，夏兆飛.牛新孢子蟲病和弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（3）：247-251.

［5］馬利青，沈艷麗.青海牦牛新孢子蟲病的血清學(xué)診斷［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，42（9）：33-34.

［6］晁萬鼎，馬利青，李文昌，等.青海省格爾木市乳牛新孢子蟲病的血清學(xué)調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)科技，2005，35（12）：1010-1014.

2011-03-15

鐵富萍（1976-），男，獸醫(yī)師。

1007-9726（2011）03-0066-02

S858.23