maFGF對衰老大鼠腦組織SOD、MDA和羥自由基及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

黃俊杰， 王彩冰， 黃麗娟， 何顯教， 黃彥峰， 趙善民， 李倩茗， 李佳荃

2009年底，我國60歲以上的老年人口已經(jīng)達(dá)到1.67億，占全國總?cè)丝诘?2.5%，中國已經(jīng)步入老齡社會。抗衰老的研究是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前的研究認(rèn)為，人類的衰老與氧自由基的損傷有關(guān)，衰老的自由基學(xué)說已得到公認(rèn)。氧自由基的損傷作用是神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要機(jī)制之一。maFGF是多功能生長因子，具有多種生物活性作用［1］。本文通過觀察maFGF對D-半乳糖致衰老大鼠腦組織中SOD活力、MDA含量和羥自由基含量和神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目，研究衰老后腦組織中自由基含量變化與神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目之間的關(guān)系，探討maFGF抗衰老的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物衰老模型與分組

取成年清潔級Wistar大鼠64只，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(動物合格證號:SCXK(桂)2009-0003)，雌雄各半，體質(zhì)量250 g左右。衰老模型每日皮下注射D-半乳糖100mg/kg，注射D-半乳糖60d后，大鼠行動遲緩，毛色松散無光澤，自發(fā)性活動減少，形體瘦弱，呈現(xiàn)明顯的衰老體征，證明衰老模型成功建立［2，3］。衰老模型模型建立成功的動物入選本實驗。入選48只Wistar大鼠隨機(jī)抽簽法分為衰老模型組、NS對照組和maFGF治療組，maFGF治療組皮下注射D-半乳糖的同時，1h后按12 μg/kg劑量肌肉注射，1次/d，共14d，maFGF由廣州暨南大學(xué)生物工程研究所提供;NS對照組皮下注射D-半乳糖的同時，1h后肌肉注射與maFGF治療組相同容量的生理鹽水，1次/d;衰老模型組只皮下注射D-半乳糖，不作任何干預(yù)。另外16只大鼠不注射D-半乳糖，作為正常對照組。各組動物飼養(yǎng)環(huán)境、條件均相同:分籠普通飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。室溫26℃，濕度50% ～60%飼養(yǎng)。

1.2 標(biāo)本采集

各組大鼠到相對應(yīng)的時間點(diǎn)斷頭處死迅速取出大腦，切塊、固定、常規(guī)乙醇脫水及浸蠟包埋、切片，行TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)(6只)。各組另10只迅速取出腦組織，用生理鹽水洗去表面殘血，取出腦組織制成腦組織勻漿，1500r/min離心10min后取腦組織上清液待測定。

1.3 腦組織中SOD活力、MDA含量和抑制羥自由基能力的測定

用UV-1700紫外可見分光光度計，在波長為550nm比色測定腦組織上清液各管吸光度值，SOD活力檢測采用黃嘌呤氧化酶法，然后根據(jù)試劑盒說明書的計算公式算出組織中SOD活力，結(jié)果以U/mgprot表示。在波長為532nm比色測定腦組織上清液各管吸光度值，MDA含量檢測采用硫代巴比妥酸法，然后根據(jù)試劑盒說明書的計算公式算出組織中MDA含量，結(jié)果以 nmol/mgprot表示。在波長550 nm處測定吸光度，運(yùn)用公式計算得到抑制羥自由基能力，規(guī)定每毫克組織蛋白在37℃下反應(yīng)1min，使反應(yīng)體系中的H2O2的濃度降低1mmol/L為一個抑制羥自由基能力單位。抑制羥自由基能力越高，則反映肝臟組織樣品中羥自由基的含量越低。腦組織勻漿蛋白定量按采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定。SOD試劑盒、MDA試劑盒和羥自由基測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法，TUNEL試劑盒由寶生物工程有限公司提供，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。凋亡細(xì)胞以細(xì)胞核呈棕黃色著色為陽性細(xì)胞(DAB法)。圖像采用德LEICA公司的病理圖像分析儀采集和分析，每切片在高倍(×400)鏡下選擇不重復(fù)的5個視野，各組切片選取部位盡量一致，計數(shù)每個視野TUNEL染色陽性的凋亡神經(jīng)細(xì)胞，取其均值為凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)用表示，采用單因素方差分析，并做LSD法兩兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 maFGF對慢性衰老大鼠腦組織SOD活力、MDA含量和抑制羥自由基能力的影響

4個組間腦組織SOD活力和MDA含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.596，P ＜0.01;F=42.478，P ＜0.01)。衰老模型組和NS對照組與正常對照組相比，SOD活力均顯著降低而MDA含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);NS對照組與衰老模型組相比，腦組織SOD活力和MDA含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);maFGF治療組與衰老模型組和NS對照組相比，SOD活力均明顯升高而MDA含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

4個組間腦組織抑制羥自由基能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.924，P ＜0.01)，即羥自由基含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。衰老模型組和NS對照組與正常對照組相比，腦組織抑制羥自由基.能力均顯著降低，表明腦組織中羥自由基的含量高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);NS對照組與衰老模型組相比，腦組織抑制羥自由基能力無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);maFGF治療組與衰老模型組和NS對照組相比，腦組織抑制羥自由基能力均明顯升高，表明腦組織中羥自由基的含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。(見表1)。

2.2 maFGF對慢性衰老大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

4組間大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞凋亡數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=27.532，P ＜0.01)。衰老模型組和NS對照組與正常對照組相比，細(xì)胞凋亡數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);NS對照組與衰老模型組相比，細(xì)胞凋亡數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);maFGF治療組與衰老模型組和NS對照組相比，細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)(見表2)。

表1 maFGF對慢性衰老大鼠腦組織SOD活力、MDA含量和抑制羥自由基能力的影響(，n=10)

表1 maFGF對慢性衰老大鼠腦組織SOD活力、MDA含量和抑制羥自由基能力的影響(，n=10)

與正常對照組比較＊＊P＜0.01;maFGF治療組與衰老模型組和NS對照組相比▲▲P＜0.01

組別 SOD活力(U/mgprot) MDA含量(nmoml/mgprot) 抑制羥自由基能力(U/mgprot)正常對照組衰老模型組NS對照組maFGF治療組221.23 ±13.52 188.64 ±16.00＊＊193.36 ±17.44＊＊216.02 ±15.77▲▲8.85 ±0.94 13.24 ±1.24＊＊14.01 ±0.60＊＊9.57 ±0.95▲▲90.37 ±6.04 77.46 ±6.79＊＊75.25 ±7.73＊＊86.51 ±5.65▲▲

表2 maFGF對慢性衰老大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)的影響(，n=6)

表2 maFGF對慢性衰老大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)的影響(，n=6)

與正常對照組比較＊＊P＜0.01;maFGF治療組與衰老模型組和NS對照組相比▲▲P＜0.01

組別 細(xì)胞凋亡數(shù)(個)正常對照組衰老模型組NS對照組maFGF治療組21.17 ±3.31 36.50 ±4.14＊＊34.67 ±4.13＊＊24.33 ±3.16▲▲

3 討論

我國已經(jīng)步入老齡社會，隨著人口老齡化趨勢的加快，抗衰老研究日益受到重視。目前的研究認(rèn)為，人類的衰老與氧自由基的損傷有關(guān)［4～7］，衰老的自由基學(xué)說已得到公認(rèn)，該學(xué)說認(rèn)為，由于諸多因素的作用，使體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基，可對生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等產(chǎn)生抗氧化損傷，導(dǎo)致機(jī)體心、肝、腎、腦等重要器官損傷老化，最終出現(xiàn)衰老。D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型因其衰老變化明顯，模型穩(wěn)定，在抗衰老研究中廣泛應(yīng)用。一般認(rèn)為給動物連續(xù)注射D-半乳糖后，因其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，致使動物組織出現(xiàn)衰老時的退行性變化及功能的改變。同時D-半乳糖在體內(nèi)氧化產(chǎn)生的大量自由基超過機(jī)體的清除能力，可引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷［8，9］。氧自由基是指由氧衍生出來的自由基及其產(chǎn)物，包括過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子等，羥基自由基被公認(rèn)是生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧物種，能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷。SOD屬于金屬酶，主要作用是歧化氧自由基，及時清除機(jī)體生成的過量自由基，以防自由基對組織細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的攻擊。SOD活力高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。自由基攻擊膜脂中的不飽和脂肪酸，使其發(fā)生氧化，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA就會升高。脂質(zhì)過氧化是造成生物體氧化損傷的主要原因。通過測定體內(nèi)MDA含量，可間接反映體內(nèi)自由基對機(jī)體的可間接反映體內(nèi)自由基對機(jī)體的損傷程度［10］。

研究表明［11，12］，氧自由基的損傷作用是神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要機(jī)制之一。氧自由基引起的DNA損傷可激活P53基因引起細(xì)胞凋亡;氧自由基攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化直接造成細(xì)胞膜的損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;氧自由基的氧化應(yīng)激可活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和AP-1，可加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡;氧自由基氧化應(yīng)激引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，可改變細(xì)胞膜的通透性使Ca2+內(nèi)流增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)為體內(nèi)廣泛分布的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞生長因子，對中胚層及神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞具有促有絲分裂作用和化學(xué)趨化性，能夠促進(jìn)神經(jīng)再生、血管生成、損傷修復(fù)，在細(xì)胞發(fā)育分化及腫瘤的形成中的作用已獲得公認(rèn)［13，14］。maFGF即是采用DNA重組技術(shù)，切除了aFGFI-25位氨基酸殘基，將26和27位氨基酸替換為蛋氨酸而研制出的非促分裂突變體［15，16］。本研究結(jié)果顯示，衰老模型組腦組織SOD活力顯著降低，MDA含量顯著升高，抑制羥自由基能力降低即羥自由基的含量升高，大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯升高。說明衰老時，羥自由基的增多，攻擊生物膜，因此脂質(zhì)過氧化物生成增多，同時，自由基增多也加速細(xì)胞凋亡，為了清除過多的羥自由基，SOD水平也下降。經(jīng)過用maFGF治療慢性衰老大鼠后腦組織SOD活力顯著升高，MDA含量和羥自由基的含量均明顯降低，大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯下降。說明maFGF起到降低自由基，提高腦組織的抗氧化能力，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞具有保護(hù)作用。

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