Aβ誘導骨髓間充質干細胞對其分化的神經細胞Tau蛋白過度磷酸化的影響

李 俊， 趙天春， 段 萍， 韓雪飛， 梁 晨， 邢 瑩

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的神經毒性是引起阿爾茨海默病(AD)神經元變性的重要因素，Aβ25-35是Aβ蛋白的主要的活性片段。骨髓間充質干細胞(MSCs)可以分化為神經細胞，應用于治療神經系統疾病。在AD患者腦中的Aβ濃度高于正常，可以引起AD的另一個重要病理改變相關蛋白Tau磷酸化水平升高。Tau蛋白是微管的主要組成之一，Tau蛋白過度磷酸化會影響神經細胞胞體與軸突營養輸送和細胞骨架的穩定。MSCs移植進入AD患者腦內，高濃度Aβ對其會有什么影響呢?我們的研究通過體外實驗在高濃度Aβ環境中，誘導MSCs分化為神經細胞，觀察體外誘導的神經細胞形態和骨架蛋白Tau的磷酸化的變化。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM、胎牛血清(FBS)均購自Thermo公司。兔抗NSE抗體、GFAP抗體、PA免疫組化試劑盒為中杉金橋公司出品;鼠抗Tau抗體為USBiologieal公司產品;EGF和bFGF均為sigma公司產品。其余試劑均為國產分析純級試劑。

1.2 動物 雄性SD大鼠，體重100g左右，普通級，由鄭州大學實驗動物中心提供。

1.3 MSCs的體外分離培養 SD大鼠斷頸處死，放入75%酒精內浸泡5min。在無菌條件下，取出脛骨和股骨，滅菌的PBS緩沖液沖洗;剪斷骨骺端，暴露骨髓腔，用加入10%FBS的L-DMEM培養液反復沖洗骨髓腔，得到的沖洗培養液吹打后，以1×106/ml接種到培養瓶，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養。3d后首次換液，7d傳代。以后每3～4d傳代，第3代后細胞純化后用于實驗。

1.4 體外誘導MSCS向神經細胞分化及Aβ的干預 將細胞分為兩組，對照組:不加Aβ，細胞達80%～90%融合時開始進行誘導分化，加入預誘導液DMEM培養基/體積分數為10%的FCS/10μg/L堿性成纖維生長因子(bFGF)培養24h，而后換為誘導液DMEM培養基/體積分數為2%(DMSO)二甲基亞砜/200μmol/L丁羥茴醚(BHA)誘導5h。誘導過程中在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。實驗組:誘導分化前24h，在細胞培養基中加入Aβ(終濃度20μmol/L)，其它同對照組。

1.5 Western blotting檢測 棄去培養基，在培養瓶中加入胰酶消化，使細胞脫落，離心去上清，PBS洗去殘留胰酶，將細胞移入0.5ml EP管，再加入100 μl細胞裂解液。震蕩混勻，冰盒靜置20min。放入低溫離心機，4℃、12000r/min、10min，取出將上清移入另一新的干凈0.5ml EP管，加入1/4體積5×蛋白加樣緩沖液，混勻，沸水浴5min。取部分蛋白樣品用BCA法進行蛋白濃度測定。根據測定的蛋白濃度，用1×蛋白加樣緩沖液將各樣本濃度調至一致。10%SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠:恒壓100V約20～30min，分離膠:恒壓150V約 50～60min)，濕轉法轉膜(恒壓150V 60～80min)，室溫封閉1h，用封閉液稀釋一抗，4℃孵育過夜，IgG二抗(1∶5000稀釋)，37℃孵育2h。ECL發光顯色，X光底片曝光。以β-actin為內參照，實驗重復3次。

2 結果

2.1 細胞形態觀察及鑒定 骨髓間充質干細胞誘導分化神經樣細胞前后細胞形態發生明顯改變，有梭形分化為伸出突起的神經樣形態(見圖1、圖2)。誘導后的實驗組細胞突起明顯短于對照組，且細胞折光性較差(見圖3)。免疫細胞化學鑒定誘導后細胞表達NSE，即誘導后的細胞為神經細胞(見圖4)。

2.2 Western blot Aβ實驗組的誘導后神經細胞GSK-3β表達明顯高于對照組細胞表達水平(見圖5)，Aβ 實驗組 Tau［pSer262］蛋白和 Tau［pSer396］蛋白表達高于對照組誘導的神經細胞(見圖 6、圖 7)

圖1 誘導前骨髓間充質干細胞(40×)

圖2 對照組誘導神經細胞(40×)

圖3 Aβ處理組誘導神經細胞(40×)

圖4 BMSC誘導后神經細胞的NSE染色(40×)

圖5 GSK-3β表達

圖6 Tau［pSer262］蛋白表達

圖7 Tau［pSer396］蛋白

3 討論

Alzheimer病(AD)是近期記憶和智力功能進行性惡化為臨床特點的一種神經系統常見疾病。AD大腦的特征性病理改變包括胞外Aβ沉積形成的老年斑和細胞內Tau蛋白異常磷酸化形成的神經元纖維纏結并伴隨神經元的大量喪失［1］。因此，如果能補充AD大腦丟失的神經元，可以為AD的治療找到一條新的途徑。骨髓間充質干細胞具有分化為神經元細胞、膠質細胞的能力，能提供大量腦組織細胞的細胞。它可以作為細胞供體，對于治療一些神經退行性疾病，具有重要的臨床意義。

大量的實驗結果和臨床資料表明，Aβ是各種原因誘發AD的共同通路，是AD形成和發展的關鍵因素［2］。淀粉瀑布樣反應假說認為AD患者腦中由于Aβ的沉積導致Tau蛋白被異常磷酸化，從而降低了微管組裝能力，導致神經功能喪失。目前大多數學者認為Aβ是AD發病的始動因素，而Tau蛋白過度磷酸化可能是AD最重要的分子病理變化之一，是其發病機制中的一個核心環節［3］。

凝聚態Aβ25-35通過GSK-3β、MAPK等激酶可使正常的神經細胞 Tau蛋白異常磷酸化增多［4，5］。Tau蛋白有21個磷酸化位點，其中只有少數位點參與調節Tau蛋白的微管結合活性［6］。Tau蛋白在ser396、ser262位點的異常磷酸化具有一定的代表性。Hardy和Higgins認為Aβ可直接引起Tau蛋白過度磷酸化和NFTs的形成，最終導致神經元退行性改變［7］。Sigurdsson等將凝聚態 Aβ25-35注射至Fischer大鼠單側杏仁核，觀察到腦內杏仁核和海馬神經元Tau蛋白異常磷酸化8d后增多，32d達到高峰，此后逐漸減弱，持續至128d。本實驗結果顯示Aβ可以促進骨髓間充質干細胞誘導的神經樣細胞的Tau蛋白磷酸化水平升高，這與在神經組織的變化相同。

在Aβ的環境中骨髓干細胞可以分化為神經細胞，但細胞的突觸明顯比正常分化組細胞突觸短。已有研究表明，在Tau缺陷的小鼠胚胎海馬細胞培養與對照Tau蛋白正常表達的細胞對比，觀察到缺陷小鼠細胞的軸突延伸延遲。說明Tau有促進軸突的生長的調節作用［8］。本實驗發現Tau磷酸化水平升高，Tau蛋白促進軸突的延伸的作用減弱。另外Tau磷酸化后影響其與微管的結合，而不能起到穩定微管的作用［9］，導致微管系統功能受損，進一步影響到軸漿運輸，同樣影響到軸突的延伸。

本研究表明，在Aβ的環境中，骨髓間充質干細胞分化為神經細胞受到明顯影響，且嚴重影響細胞功能，故在AD患者采用骨髓干細胞移植時，應該采取相應措施以減少Tau異常磷酸化，例如移植細胞部位注入 GSK-3β抑制劑以減少 Tau蛋白磷酸化［10］。

［1］Castellani RJ，Rolston RK，Smith MA.Alzheimer disease［J］.Dis Mon，2010，56(9):484-546.

［2］Ryan SD.Amyloid-beta42 signals Tau hyperphosphorylation and compromises neuronal viability by disrupting alkylacylglycerophosphocholine metabolism［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(49):20936-20941.

［3］Hampel H.Total and phosphorylated Tau protein as biological markers of Alzheimer’s disease［J］.Exp Gerontol，2010，45(1):30-40.

［4］Huang J.Unilateral amyloid-beta25-35 injection into the rat amygdala increases the expressions of aberrant Tau phosphorylation kinases［J］.Chin Med J(Engl)，2010，123(10):1311-1314.

［5］Sigurdsson EM.Local and distant histopathological effects of unilateral amyloid-beta 25-35 injections into the amygdala of young F344 rats［J］.Neurobiol Aging，1996，17(6):893-901.

［6］Gendron TF，Petrucelli L.The role of Tau in neurodegeneration［J］.Mol Neurodegener，2009，4:13.

［7］Hardy JA，Higgins GA.Alzheimer’s disease:the amyloid cascade hypothesis［J］.Science，1992，256(5054):184-185.

［8］Morsch R，Simon W，Coleman PD.Neurons may live for decades with neurofibrillary tangles［J］.J Neuropathol Exp Neurol，1999，58(2):188-197.

［9］Fath T，Eidenmuller J，Brandt R.Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2002，22(22):9733-9741.

［10］Medina M，Avila J.Glycogen synthase kinase-3(GSK-3)inhibitors for the treatment of Alzheimer’s disease［J］.Curr Pharm Des，2010，16(25):2790-2798.