重金屬鉻脅迫對土壤微生物數量及酶活性的影響1)

魏 遠

(中國林業科學研究院林業研究所，北京，100091)

鄭施雯 朱建林 江澤平 陳 江

(寧波市環境保護科學研究設計院) (寧波大學) (中國林業科學研究院林業研究所) (寧波大學)

當今，隨著現代工農業的迅速發展，“三廢”排放的日益增加，環境問題日趨嚴重，特別是重金屬污染已引起國內外專家的極大關注。我國是世界皮革的加工中心和制革大國，制革行業每年約產生140萬t皮革廢棄物，其大部分被隨意丟棄，其中所含的重金屬Cr對土壤環境造成了嚴重污染［1］。重金屬Cr具有易積累、難排除的特性，不僅危害土壤質量、地下水安全、作物產量品質，而且會隨著食物鏈潛在威脅人畜健康。微生物本身僅占土壤有機質的很小部分，但土壤微生物在C、N、S和其他元素循環中起著關鍵作用［2］。土壤微生物功能群的研究意義不僅關系到農業生產，而且關系到環境污染治理和恢復生態學領域［3-4］。土壤中一切生物化學過程都離不開土壤中各類酶的參與，同時土壤酶活性是衡量土壤生物學活性和土壤生產力的重要指標［5］，其活性的大小能反映土壤的潛在肥力水平，可較敏感地反映土壤中生化反應的方向和深度，是探討重金屬污染生態效應的有效指標之一［6］，在重金屬生態毒理、污染監測評價及修復等方面研究中，土壤酶是國內外關注的主要課題之一。近年來，國內外相關研究先后提出了脲酶、轉化酶、過氧化氫酶等重金屬污染指標［7-8］。目前，關于重金屬Cr對土壤微生物及酶的影響報道不多，但關于工業產生的一些含Cr廢水對土壤微生物及酶的影響卻鮮見報道［9-13］，而制革等行業都會產生較高質量濃度的含Cr廢水。本研究旨在研究重金屬Cr對土壤微生物及脲酶和過氧化氫酶活性的影響，從而間接明確重金屬Cr對土壤肥力狀況的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2008年在寧波大學內建造面積約為140 m2的實驗溫室大棚，進行土培Cr脅迫試驗。根據課題實施計劃從浙江寧波奉化苗圃購入柏木(Cupressus funebris Endl.)、側柏(Platycladus orientalis(Linn.)Franco)、刺柏(Juniperusformosana Hayata)、女貞(Ligustrum lucidum Ait.)、桂花(Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.)、夾竹桃(Nerium indicum Mill.)、四季竹(Oligostachyum lubricum(Wen)Keng f.)、銀 杏 (Ginkgo biloba Linn.)、杜鵑(Rhododendron simsii Planch.)、山茶(Camellia japonica Linn.)、臭椿(Ailanthus altissima(Mill.)Swingle)、棕櫚(Trachycarpus fortunei(Hook.)H.Wendl.)、廣玉蘭(Magnolia grandiflora Linn.)、樟 樹 (Cinnamomum camphora(L.)Presl)、大花美人蕉(Canna generalis Bailey)和爬山虎(Parthenocissus tricuspidata(Sieb.et Zucc.)Planch.)共 16 種植物作為試驗植物種質，試供土壤為奉化苗圃土，土壤pH值6.5，有機質質量分數為3.27%。

1.2 重金屬處理

將買回的植物種入上直徑為36 cm，高為30 cm的陶瓷盆內，向土壤中加入不同質量濃度的Cr作為處理，Cr以CrCl3·6H2O形態溶于水箱的水中，通過ZQDF型蒸汽電磁閥和HT-12K微電腦多功能控制器將處理過的水定時定量通過滴灌系統注入每盆試供植物的土壤中，對于部分滴水效果不太理想的進行人工澆灌已知質量濃度的Cr溶液，來保證不同處理水平達到試驗預定的Cr質量濃度要求。共設置對照組(CK，不加Cr)和7、14、21 mg·L-1(以Cr3+計)3個處理水平(分別定義為處理1、處理2和處理3)，每個水平每種植物設置5個平行。2008年6月，將買入的試供植物種入盆內，穩定生長5個月，從2008年12開始運行，除去寒假實驗室停電裝置暫停運行一個月外，至2009年8月共運行9個月。

1.3 采樣方法

土樣于2009年9月采集，根據常規取樣方法，在各處理水平下分別對栽種每種植物的5個盆進行采樣，采集5～20 cm的土壤層，混合均勻不同樣點土樣及植物幼根，裝入無菌袋內，放入冰盒帶回實驗室，供測定研究使用。

1.4 測定方法

土壤主要化學性質測定：土壤pH值(H2O)的測定采用電位法，使用pHs-25型pH計(雷磁)測定。土壤有機質質量分數的測定采用重鉻酸鉀容量法測定。

土壤重金屬測定：土壤中重金屬含量測定采用微波消解—原子吸收分光光度法。精確稱取土壤樣品0.400 0 g于ETHOS1/A微波消解儀(MDS)消解罐中，加8 mL HNO3和2 mL H2O2，運用消解儀設定的消解程序進行消解，結束后開罐趕酸，用超純水將消解液轉入50mL容量瓶中定容，過濾去除雜質，待測。待測溶液視測定條件酌情適當稀釋。分析過程分別加入國家標準土壤樣品(GSS-1)和國家標準植物樣品(GSV-3)進行分析質量控制。待測溶液通過TAS-990原子吸收分光光度計(北京普析)進行測定。

土壤樣品微生物測定：微生物數量的測定采用菌落平板計數法。不同類群的微生物使用不同的培養基，細菌的培養基為牛肉膏蛋白胨培養基，放線菌為高氏1號培養基，真菌為薩布(Sabouraud’s)培養基［14］。28～30 ℃培養，定時觀察、計數(Shineso全自動菌落計數儀AS1)。

土壤酶活性測定：土壤脲酶活性的測定采用苯酚—次氯酸鈉比色法，其活性以24 h后1.0 g土壤中NH3-N的毫克數表示;土壤過氧化氫酶活性的測定采用容量法［15］。

數據相關分析、回歸分析及繪圖工作由 Origin8.0、SPSS13.0和MATLAB7.0等分析軟件完成。

2 結果與分析

2.1 Cr脅迫對土壤的基本理化性質的影響

從奉化苗圃運回的供試土壤pH值6.5，有機質質量分數為3.27%。經過9個月的土培試驗后，土壤的基本理化性質見表1。從表1可以看出：土壤pH均呈一定的酸性，且在一定程度上有所降低，不同植物生長的土壤pH也有所不同(具體數據未列出);土壤中有機質質量分數均較低，該土屬于低肥土，有機質的質量分數也有所降低，不同植物生長的土壤有機質也有所不同(具體數據未列出)。這可能是由于滴灌系統用水pH呈弱酸性，未對土壤進行施肥，盆栽試驗植物生長以及土壤中Cr3+的加入等的綜合作用的結果。

表1 土培Cr脅迫試驗后土壤基本理化性質

從奉化苗圃運回的供試土壤的Cu、Pb、Zn、Cr質量分數分別為 45.31、63.19、95.24、180.46 mg·kg-1，其質量分數均大于全國的土壤背景值，但均在土壤環境質量二級標準(GB15618—1995)以內，可認為供試土壤是無重金屬污染土壤。經過9個月的土培試驗后，土壤重金屬質量分數測定結果見表2。3個處理水平及對照組土壤的4種重金屬(Cu、Pb、Zn、Cr)的質量分數均大于全國的土壤背景值。其中經過處理后的土壤Cr質量分數很高，是全國背景值的7～13倍。從土壤環境質量二級標準(GB15618—1995)來看，經過處理后的土壤Cr質量分數已經超過污染警戒值，是二級標準的1.7～3.6倍，可能是由于試驗時間還不夠長，對試驗結果基本不產生影響。土培試驗結束后經處理后的土壤Cu、Pb、Zn質量分數以及對照組的Cu、Pb、Zn、Cr質量分數均在二級標準以內，較供試土壤的原始質量分數有所降低，但降低的程度很小。

表2 不同土培試驗下土壤重金屬質量分數 mg·kg-1

2.2 Cr脅迫對土壤微生物數量的影響

土壤微生物是決定土壤生物化學特性的重要組成部分，其數量的多少直接影響土壤的物理、生物和化學性質，決定著土壤養分的組成與轉化，同時也是評價土壤肥力的重要指標之一。目前，采用微生物學指標來表征土壤重金屬污染越來越受到人們的普遍關注。龍健等［16］研究發現，銅礦區重金屬污染對土壤環境質量微生物學指標有較大的影響。土壤微生物對重金屬的脅迫要比同一環境中的動物和植物敏感得多，被認為是最有潛力的評價土壤環境質量的指標［17］。從表3中可以看出：對于同一個處理下的土壤，3大類微生物的數量呈現出相似的變化特點，即：細菌＞放線菌＞真菌。細菌的營養類型多樣，呼吸機制復雜，代謝旺盛，繁殖快，所以各處理水平中的細菌的數量最多。土壤中的放線菌主要以鏈霉菌為主，大部分放線菌屬好氧腐生菌，對纖維素、幾丁質、固醇類等結構復雜的難降解天然有機物有較強的利用能力。一般來說，土壤中的真菌數量總是小于細菌和放線菌的數量，但由于其孢子、菌核和菌索的忍耐力較強，因此，可廣泛分布于各種類型的土壤中。對于對照組(CK)及3個不同Cr處理的土壤，對照組中的細菌、放線菌和真菌，其數量均為最大，隨著處理質量濃度的不斷增大，土壤中的細菌、放線菌和真菌均有不同程度的降低。

2.3 Cr脅迫對土壤脲酶活性的影響

土壤脲酶在土壤系統氮素循環過程中起著重要作用，人們常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素狀況［18］。在研究重金屬對土壤污染時，通常將土壤對土壤脲酶的影響作為一個主要內容。國內外學者對重金屬污染條件下的酶活性進行了大量的研究，對于土壤脲酶，重金屬對其活性的影響與重金屬種類和濃度以及土壤理化性質有關［19-20］。楊志新等［21］通過回歸正交試驗發現，重金屬對土壤酶活性的抑制效應順次為Cd＞Zn＞Pb;同時，Cd、Zn、Pb復合污染對土壤脲酶表現出協同抑制負效應的特征，在過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶、轉化酶中，脲酶受重金屬的抑制作用最為敏感。有關土壤中的Cr對脲酶的影響方面的研究較少，蔡少華等［22］采用室內模擬方法較為系統地研究了六價水溶態鉻和總鉻對土壤脲酶活性的影響，結果表明六價鉻抑制土壤脲酶活性，其活性與六價水溶態鉻達到極顯著負相關，揭示脲酶活性可作為土壤Cr污染程度的指標之一;對于低肥土，土壤中六價總鉻質量濃度增加，脲酶活性持續遞減。對于三價鉻對土壤脲酶活性的研究少之甚少，因此筆者研究了不同Cr3+處理水平下土壤總Cr質量濃度對土壤脲酶活性的影響。結果表明，不同樣點土壤脲酶活性存在一定程度的差異性，其變化范圍：處理1為0.301～0.721 mg·(g·d)-1;處理2 為0.214～0.404 mg·(g·d)-1;處理3 為0.101～0.389 mg·(g·d)-1;對照組(CK)為0.503～0.861 mg·(g·d)-1。從相關系數來看，脲酶活性的變化幅度較大。總體來說，Cr的加入抑制了土壤脲酶的活性。從圖1中可知，脲酶活性與土壤Cr質量分數呈顯著的負相關(相關系數r=-0.862，p＜0.01)，揭示Cr可明顯抑制土壤脲酶活性。

表3 不同水平Cr脅迫下土壤中微生物數量 ×105

圖1 脲酶活性與土壤的Cr金屬質量分數回歸分析

2.4 Cr脅迫對土壤過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶廣泛存在于土壤中和生物體內，其活性在一定程度上反映了土壤微生物學過程的強度，也可表征土壤總的生物學活性和肥力狀況。由于土壤中一些酶的活性能較穩定、敏感地反映重金屬對土壤的污染程度，人們開始注重探討用土壤酶活性作為判定土壤污染程度的生化指標。目前已經有人發現用脲酶、過氧化氫酶活性可作為判斷土壤中全量Cd、Pb 污染程度的主要生化指標［10，23-24］。Naseby 等［25］研究發現，Cd、Zn、Pb共存時，其對過氧化氫酶表現出一定的拮抗作用或屏蔽作用，尤其Pb質量濃度較高時，屏蔽作用較為明顯。羅虹等［26］采用回歸正交設計方案，研究了 Cd、Cu、Ni復合污染對6種土壤酶(脲酶、轉化酶、蛋白酶、磷酸酶、過氧化氫酶、脫氫酶)活性的影響，結果表明：6種土壤酶活性與Cd、Cu、Ni復合污染之間均呈顯著或極顯著的相關性，但對酶活性的影響存在明顯的差異，Cd、Cu對其活性的影響多表現為抑制性，而Ni則多表現為激活作用。但對于土壤中重金屬Cr對土壤過氧化氫酶活性影響方面的研究很少。本研究結果表明，不同樣點土壤過氧化氫酶活性存在一定程度的差異性，其變化范圍：處理1 為3.468～13.176 mL·(g·h)-1;處理2 為3.402～12.405 mL·(g·h)-1;處理3 為1.527～11.90 mL·(g·h)-1;對照組(CK)為 5.235～15.549 mL·(g·h)-1。從相關系數來看，過氧化氫酶活性的變化幅度一般。總體來說，Cr的加入抑制了土壤過氧化氫酶的活性。從圖2中可知，過氧化氫酶活性與土壤Cr質量分數呈顯著的負相關(相關系數 r=-0.650，p＜0.01)，揭示 Cr可抑制土壤過氧化氫酶活性。

圖2 過氧化氫酶活性與土壤Cr金屬含量回歸分析

3 結束語

在土培Cr脅迫試驗中，處理水平下土壤中微生物數量為細菌＞放線菌＞真菌，土壤中重金屬Cr質量濃度的增加在一定程度上抑制微生物的生長，最終導致土壤中的細菌、放線菌和真菌數量的減少。土壤脲酶活性與土壤Cr質量分數呈顯著的負相關(r=-0.862)，揭示Cr可明顯抑制土壤脲酶活性，機理可能是由于Cr與土壤脲酶活性中心或與酶分子的巰基、氨基和羧基結合，影響了土壤酶與底物的結合［25］，最終導致酶活性降低，表明土壤脲酶活性在一定程度上可監測土壤受三價鉻污染程度。過氧化氫酶活性與土壤Cr質量分數呈顯著的負相關(r=-0.650)，揭示Cr可抑制土壤過氧化氫酶活性，但其抑制效應低于Cr對土壤脲酶活性的抑制，表明其活性在一定程度上也可表征土壤受三價Cr污染程度。

［1］周加祥，劉錚.鉻污染土壤修復技術研究進展［J］.環境污染治理技術與設備，2000，1(4)：52-56.

［2］李阜隸，喻子牛，何紹江.農業微生物學實驗技術［M］.北京：中國農業出版社，1996.

［3］于壽娜，廖敏，黃昌勇.鎘、汞復合污染對土壤脲酶和酸性磷酸酶活性的影響［J］.應用生態學報，2008，19(8)：1841-1847.

［4］趙萌，李敏，王淼焱，等.西瓜連作對土壤微生物主要類群和土壤酶活性的影響［J］.微生物學通報，2008，35(8)：1251-1254.

［5］周禮愷.土壤酶學［M］.北京：科學出版社，1987.

［6］王新，周啟星.土壤重金屬污染生態過程、效應及修復［J］.生態科學，2004，23(3)：278-281.

［7］尹君，高如泰，劉文菊，等.土壤酶活性與土壤Cd污染評價指標［J］.農業環境保護，1999，18(3)：130-132.

［8］李博文，劉樹慶.潮褐土鎘、鋅、鉛復合污染與土壤酶活性的關系［J］.吉林農業科學，2000，25(1)：38-41.

［9］蔡少華，和文祥，呼蕾，等.六價鉻對土壤脫氫酶活性的影響［J］.西北農業學報，2008，17(5)：208-214.

［10］周禮愷，張志明，曹承綿，等.土壤的重金屬污染與土壤酶活性［J］.環境科學學報，1985，5(2)：176-184.

［11］Grigorydn K V，Galstyan A S.Effect of irrigation water polluted with industrial waste on the enzymatic activity of soils［J］.Soviet Soil Science，1979，11(2)：220-228.

［12］和文祥，陳會明，馮貴穎，等.汞鉻砷元素污染土壤的酶監測研究［J］.環境科學學報，2000，20(3)：338-343.

［13］Renella G，Origoza A L R，Landi L，et al.Additive effects of copper an zinc on cadmium toxicity on phosphatase activities an ATP content of soil as eatimated by the ecological dose(ED50)［J］.Soil Biology ＆ Biochemistry，2003(35)：1203-1210.

［14］黃秀梨.微生物學實驗指導［M］.北京：高等教育出版社，2001.

［15］關松蔭.土壤酶及其研究法［M］.北京：中國農業出版社，1986.

［16］龍健，黃昌勇，縢應，等.礦區重金屬污染對土壤環境質量微生物學指標的影響［J］.農業環境科學學報，2003，22(1)：60-63.

［17］孫波，趙其國，張桃林，等.土壤質量與持續環境Ⅲ：土壤質量評價的生物學指標［J］.土壤，1997，29(5)：225-234.

［18］和文祥，朱銘莪，張一平.土壤酶與重金屬關系的研究現狀［J］.土壤與環境，2000，9(2)：139-142.

［19］滕應，駱永明，李振高.土壤重金屬復合污染對脲酶、磷酸酶及脫氫酶的影響［J］.中國環境科學，2008，28(2)：147-152.

［20］孫兆海，鄭春榮，周東美，等.土壤鉛污染對青菜和蕹菜生長及脲酶活性的影響［J］.農村生態環境，2005，21(1)：38-43.

［21］楊志新，劉樹慶.重金屬Cd、Zn、Pb復合污染對土壤酶活性的影響［J］.環境科學學報，2001，21(1)：60-63.

［22］蔡少華，和文祥，梁艷茹，等.六價鉻污染土壤后形態變化及其對土壤脲酶活性的影響［J］.農業環境科學學報，2009，28(2)：251-255.

［23］史長青.重金屬污染對水稻土酶活性的影響［J］.土壤通報，1995，26(1)：34-35.

［24］劉樹慶.保定市污灌區土壤的Pb、Cd污染與土壤酶活性關系研究［J］.土壤學報，1996，33(2)：175-182.

［25］Naseby D C，Lynch JM.Rhizosphere soil enzymesasindicators of perturbations caused by enzyme substrate addition and inocubation of a genetically modifled strain of Pseudomonas fluoresces as wheat seeds［J］.Soil Biol Biochem，1997，29：1353-1362.

［26］羅虹，劉鵬，宋小敏.重金屬鎘、銅、鎳復合污染對土壤酶活性的影響［J］.水土保持學報，2006，20(2)：94-96，121.