不同林齡麻瘋樹林地土壤細菌分布特征1)

陳喜英 谷 勇

(中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，昆明，650224)

熊 智 殷 瑤 董 平

(西南林業大學) (中國林業科學研究院資源昆蟲研究所) (中國石油天然氣股份有限公司石油化工研究院)

土壤微生物對維持土壤系統穩定性、健康和質量非常關鍵［1］，對植物生長具有重要作用［2］。土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分之一，微生物數量多，土壤生物活性強，土壤養分供給充足，可以作為評價土壤肥力的重要指標之一［3-6］。土壤中細菌、放線菌、真菌三大類微生物比例是土壤肥力的一個衡量指標，土壤中細菌、放線菌密度高，表明土壤肥力水平高。土壤微生物群落結構的變化會直接影響土壤功能的發揮［7］。目前，對麻瘋樹(Jatropha curcas L.)林地土壤細菌的研究少有報道，對林地土壤微生態環境的認識比較模糊。因此對不同林齡麻瘋樹林地土壤細菌進行研究很有必要，本研究采用空間序列代替時間序列的方法，探討了位于永勝縣不同發育階段麻瘋樹林地土壤細菌數量及類群的變化，分析了其與土壤養分的關系，進一步為麻瘋樹林地土壤肥力的變化、養分的轉化及麻瘋樹林地的健康評價提供科學依據。

1 試驗地概況

試驗地位于云南省麗江市永勝縣熱河，東經100°33'34.1″～100°36'44.9″，北緯 26°6'3.6″～26°15'31.0″，海拔 1 230 m，屬低緯山地季風氣候類型。年平均氣溫13.5℃，最冷月平均氣溫6.1℃，最熱月平均氣溫19.0℃，極端最高氣溫32.3℃，極端最低氣溫-11.2℃。年平均降水924 mm，年平均日照時間2 403.6 h。年平均相對濕度67%。采樣地的土壤植被等基本情況見表1。

2 材料與方法

土樣的采集：2010年8月在永勝縣從1～10、11～20、21～30年生麻瘋樹林地選擇3塊樣地。采集麻瘋樹林地0～30 cm的土壤，5 cm為一個層次，共7個層次。采用土壤剖面取樣法，自下而上取樣，每層取2份樣，每份大約取10 g，一份裝入密封袋用于細菌的測定，另一份裝在鋁盒中用于含水率的測定［8］。同時在此剖面中取測定營養元素的土樣，將各土層的樣品混合在一起，在實驗室自然風干后送到云南省林業科學院重點實驗室進行分析。

主要儀器和試劑：細菌培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基，基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京百泰克生物公司。16SrDNA的PCR引物正向為27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAAGGCT-3';反向為 1492r：5'-TACGGCTACCTTGTTACGA CTTCACCCC-3'［9］。由上海生工生物工程技術公司合成。選擇Hin dⅢ酶、HaeⅢ酶、Hin fⅠ酶進行酶切，所有的酶全部購自Fermentas公司。采用Bio-RAD的Gel Doc-2000凝膠影像系統觀察電泳條帶并拍照。

表1 樣地的土壤植被概況

土壤含水量的測定：稱取待測土樣經105℃烘干8 h，至于干燥器中，待冷卻后稱質量，土壤含水量=(濕土質量-干土質量)/濕土質量 ×100%［10］。

土壤細菌的測定：①倒平板。將制備好的牛肉膏蛋白胨培養基和培養皿滅菌后，把培養基倒入培養皿中，凝固后成平板，備用。②制備土壤稀釋液。從每個土層中稱取土樣1 g放入盛9 mL無菌水的試管中充分混勻，制成10-1的土壤懸液，然后按10倍法依次稀釋至10-6。根據預實驗，選擇10-6的稀釋液，做3個重復。③涂布、培養和計數。用移液槍從試管中抽取1 mL稀釋液放入平板中，用無菌玻璃刮刀將接種物均勻的涂布開。將平板倒置于28℃的培養箱中培養，24 h計數一次，直到菌落數不再增加。根據公式：每克干土中菌數(個/g)=菌落平均數×稀釋倍數/(1-土壤含水量)，計算每克干土中的微生物數量。④純化。將每個土層長出的菌落根據顏色，透明度等外部特征進行篩選，將不同的菌落分別挑取少許細胞接種分離培養，直到長出單個菌落，此時轉接到已制備好的裝有培養基的試管中，待菌落完全長好后放在冰箱中4 ℃保存備用［11-14］。

土壤營養元素的測定：①有機質質量分數測定采用油浴外加熱—重鉻酸鉀法。②有效氮質量分數測定采用康氏皿堿解擴散法。③有效磷質量分數測定采用硫酸—鹽酸浸提—鉬銻抗比色法。④有效鉀質量分數測定采用1N醋酸銨浸提—ICP-AES(TJA)法測定［15］。

細菌DNA提取、16SrDNA的PCR及酶切：將3種林齡的土壤中提取的43個細菌接種到裝有牛肉膏蛋白胨培養基(不加瓊脂)的試管中，待渾濁度達到0.7左右進行細菌DNA的提取，細菌DNA的提取按照試劑盒中的步驟進行，提取出的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。PCR反應時的條件，95℃預變5 min，30個循環為95℃變性3 min，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，最后72℃下終延伸10 min。擴增后的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。擴增后的PCR產物選用 Hin fⅠ、HaeⅢ、Hin dⅢ3種酶進行酶切，Hin dⅢ和HaeⅢ一起進行酶切。酶切體系的條件，16S rDNA PCR產物10.0 μL，水16.0 μL，10 ×Buffer R 2.0 μL，Hin dⅢ 1.5μL，HaeⅢ 1.5μL;Hin fⅠ酶切體系的條件，16SrDNA PCR 產物 10.0 μL，水16.5 μL，10 × Buffer R 2.0 μL，Hin fⅠ1.5 μL，均在 37℃的水浴鍋中酶切12 h。再用1.5%瓊脂糖凝膠90 V電壓電泳 1.5 h，檢測條帶并拍照［16-19］。

統計分析：細菌數量的計算用Microsoft Excel 2003處理，雙因素方差分析和二元變量的相關性分析采用Spss17.0處理，類群的聚類在MVSP軟件上進行［20-21］。

3 結果與分析

3.1 土壤細菌的數量分布

由表2可知，細菌數量在3種林齡間的差異顯著(p＜0.05)，1～10年生的麻瘋樹細菌數量在各土層中均最多，21～30年生的麻瘋樹細菌數量在各土層中均最少。細菌數量在土壤表層、0＜土壤深度d≤5 cm、20 cm＜d≤25 cm之間差異不顯著(p＞0.05)，土壤表層、0 ＜ 土壤深度(d)≤5 cm、20 cm＜d≤25 cm 與5 cm ＜d≤10 cm、10 cm ＜d≤15 cm、15 cm＜d≤20 cm、20 cm＜d≤30 cm之間差異顯著(p＜0.05)，3種林齡中均表現為15 cm細菌數量最多，30 cm細菌數量最少。

表2 不同林齡麻瘋樹土壤細菌數量 107個·g-1

3.2 土壤細菌的類群組成

對從3個麻瘋樹林齡中提取出的土壤細菌43個類群擴增后的16SrDNA進行酶切(見圖1，圖2)。首先把電泳圖譜的帶型轉換成0、1數據，用MVSP軟件進行聚類分析。通過聚類分析表明(圖3)，在相似系數100%時，3塊樣地中提取的43種細菌歸屬于37個類群。1～10年生的麻瘋樹林地有24 個類群，分別為 1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、19、21、24、25、26、27、28、31、32、35、36、39、41、42 號菌。11～20 年生的麻瘋樹林地有22 個類群，分別為 1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、15、16、19、21、24、28、32、35、37、41、43 號菌。21～30 年生麻瘋樹林地有 18 個類群，分別為 1、3、5、6、9、10、11、12、15、19、21、24、26、27、28、31、32、35 號菌。可見，隨著林齡的增加，類群數越來越少，菌類組成也發生了改變。

3.3 土壤營養元素與細菌數量的關系

對不同林齡麻瘋樹林地土壤細菌數量與土壤營養元素進行二元相關性分析的結果表明，細菌與全鉀、有效氮、有效鉀、有效磷呈極顯著性正相關，與全氮呈顯著性正相關，與全磷相關性不顯著，與有機質呈極顯著負相關(表3)。

圖1 細菌Hin dⅢ和HaeⅢ酶切電泳圖

圖2 細菌Hin fⅠ酶切電泳圖

圖3 麻瘋樹林地土壤細菌的聚類分析圖

表3 麻瘋樹林地土壤細菌數量與土壤化學因子之間的相關性

4 結論與討論

土壤細菌數量分布受當地氣候條件、水份狀況、土壤營養狀況、土壤質地、植被組成和覆蓋度的綜合影響［22］。在不同發育階段的麻瘋樹林地內，隨著林齡的增加，土壤細菌數量呈現遞減趨勢。這和喬海莉對新疆天然胡楊林土壤微生物多樣性的研究略有不同［23］，可能是因為隨著林齡的增加，郁閉度和植株生物量增加，因此落葉增加，由于葉子里面含有毒性成分［24-25］，可能限制了某些細菌的生長，從而導致細菌數量下降，但具體抑制作用還有待于進一步研究。

土壤細菌數量的垂直分布也存在一定差異，通過方差分析可知，土壤深度對細菌數量影響顯著，在10 cm＜d≤15 cm處分布較多，15 cm＜d≤20 cm處開始減少。20 cm土層以下雖然富含植物根系，但卻蘊涵大量石塊，土壤密度逐漸增大，孔隙度較小，因此細菌隨土壤深度增加而逐漸減少。細菌多分布在5 cm＜d≤15 cm處，這與此處根系分布密集，根系分泌物多，孔隙度高，水分充足，為其提供了豐富的營養和適宜的生存條件關系密切。由于樣地表面土壤干燥及表層根系分布較少，因此表層細菌的數量比5 cm＜d≤15 cm處的少。

細菌類群數與土壤肥力及林地健康狀況有密切的關系［22］。各類群數量越少，使得土壤中營養元素循環速率和能量流動減弱，土壤生態環境變得越不利于細菌的繁殖和植物的生長［26］。本研究中隨著林齡的增加土壤細菌類群組成產生了改變，各類群數量也呈現減少的趨勢，說明土壤肥力有下降的趨勢及土壤微環境不穩定。

對于該麻瘋樹生態系統，影響土壤細菌數量的土壤營養元素中，細菌數量與全鉀、有效氮、有效鉀、有效磷呈極顯著性正相關，與全氮呈顯著性正相關，因此全鉀、全氮、有效氮、有效鉀、有效磷在影響細菌的生長發育中起著重要作用，所以在以后的土壤管理中應加強這幾種營養元素的補充;全磷的影響較小，由于3個林齡中全磷能夠滿足細菌的生長，因此相對其他因子相關性不顯著，但還需要進一步研究，并且宜放大時間尺度和研究對象的范圍;與有機質呈極顯著負相關，有機質主要來源于麻瘋樹的枯枝落葉，因為枯枝落葉中含有有毒成分，可能產生化感作用，抑制細菌的生長，這還有待于進一步研究。

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