野菊內生真菌生物多樣性與生態分布1)

盧東升 王明好 賈 曉

(信陽師范學院，信陽，464000)

野菊［Dendranthema indicum(L.)Des Moul.］為菊科多年生草本植物，其莖、葉、花均可人藥，有清熱解毒、消炎殺菌、涼血祛腫等功效，能治療疔瘡癤腫、乳腺炎、淋巴結結核、胃腸炎、高血壓，亦可防治流感、流行性腦膜炎、肺炎、百日咳等。人們對野菊的藥用成分及其功用已進行了系統研究，但關于野菊內生真菌的研究未見報道［1-2］。內生真菌對宿主植物生長、發育、生理代謝均具有重要影響［3］。為了解野菊花內生真菌的種類、分布特點，為內生真菌有益次生代謝物的研究與利用提供依據，筆者于2010年7月至9月在豫南地區選擇了5個樣地，通過標樣采集，內生真菌的分離與鑒定，對此進行了初步研究。

1 材料與方法

培養基：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PSA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，自然 pH值。倒平板時每100 mL培養基中加入5滴無菌的25%乳酸溶液，以抑制細菌生長;促孢培養基：KH2PO41 g，KNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KC1 0.5 g，淀粉 0.2 g，葡萄糖 0.2 g，蔗糖 0.2 g，瓊脂 15 g，水1 000 mL，pH值自然;水瓊脂培養基：瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然。

標樣采集：在河南省信陽市選取不同生境條件下的野菊樣地5個(編號分別為 XX、XJH、XS、XHG、NW)。選健康野菊植株，采集沒有腐爛發霉及病斑、病害的健康新鮮嫩枝、老枝、葉片、花蕾等器官適量，分別裝入無菌紙塑料袋中，存于4℃冰箱保存備用。

內生真菌的分離與鑒定：葉、花蕾內生真菌的分離同文獻［4］，莖內生真菌分離前，先用自來水將表面沖洗干凈，晾干水分后切成3 cm長的莖段，分別用75%乙醇、2%次氯酸鈉、75%乙醇消毒2、10、1 min，不同消毒劑消毒后均用無菌水沖洗3次，最后將莖段切成0.5 cm短段，老莖縱切成4等份。將莖段接入PSA平板，在28℃恒溫箱內培養，組織塊出現明顯菌落時，依據菌落形態特點挑取不同真菌頂端菌絲轉接PSA斜面，25℃恒溫培養。將分離純化后的真菌用不同基質的培養基誘導產孢，觀察記錄菌落、菌絲、產孢結構及孢子形態結構特征，參考有關專著［5-7］進行鑒定。

觀測指標：統計內生真菌在野菊5種植物組織中的定殖率、分離率、多樣性指數、相似性系數。計算方法按文獻［8］。

2 結果與分析

2.1 野菊內生真菌的組成與分布

本研究共取野菊組織1 104塊，經分離純化得到內生真菌948株，其中770株能產生孢子，依據其形態特征鑒定為15屬21種，它們絕大多數屬半知菌，極少數為子囊菌。另有178株(18.3%)經誘導未產生孢子，為非產孢菌株。產孢真菌的分離率及分布見表1，可知，刺盤孢菌(Colletotrichum spp.)、擬莖點霉(Phomopsis spp.)、大莖點霉(Macrophoma sp.)3個屬真菌在各個樣地的野菊各器官均有分布，分離率高達40.7%～60.4%，是野菊優勢內生真菌。另外，莖、葉和花器官均有專化的內生真菌棲息，說明內生真菌分布具有明顯的組織專一性。

2.2 野菊內生真菌定殖率

內生真菌在各樣地野菊各器官均可定殖，且定殖率較高，總體達79.2%～99.3%，但不同樣地野菊內生真菌定殖率存在明顯差異。按定殖率大小排列依次為：XS(99.3%)＞XX(84.9%)＞NW(83.6%)＞XJH(82.5%)＞XHG(79.2%)。從組織水平上看，內生真菌在老枝定殖率最高(95.8%)，其次為葉片(92.0%)，花蕾的定殖率最低(77.8%)。由實驗結果可知，內生真菌在野菊花體內的定殖與植物體生存的外部環境有關，也與其器官組織結構、生化條件等內部微生態環境密切相關。處于陰地濕度較大環境條件下的野菊花，內生真菌定殖率較高，反之，在光照強度大且較干燥的環境內，其內生真菌定殖率較低。菊花內生真菌的定殖率與器官組織的嫩度成反比，嫩度愈大，定殖率愈低，嫩度越小，定殖率越高。

2.3 野菊內生真菌的多樣性與相似性

供試的野菊5個樣地，其內生真菌的多樣性指數不同，從高 到低的順序為XX(2.17)、XJH(1.88)、XS(1.68)、XHG(1.65)、NW(1.46);在供試的 5 種器官中，其內生真菌的多樣性指數較接近，但也有不同，從高到低排列為花蕾(1.48)、葉柄(1.35)、葉片(1.33)、老莖(1.23)、嫩莖(1.13)(表2)。以上數據說明野菊花生存外部的環境對內生真菌的多樣性有明顯影響。樣地XX、XJH野菊花均生于林下，生境陰閉且濕度大，為不同真菌在植物體內的棲息提供了較好的環境條件，而樣地NW野菊花生于向陽的山坡雜草叢，生境較干燥，不利于內生真菌的定殖。不同樣地之間，野菊花內生真菌種類組成的相似性系數在0.375～0.875范圍內，其中樣地XHG與XX之間相似性系數最高(0.875)，而樣地XS與NW之間相似性系數最低(0.375);樣地XS、XHG、XJH之間的相似性系數較高(0.778～0.857)，但樣地 NW 與 XJH、XS、XHG 之間內生真菌的相似性系數較低(0.375～0.462)(表3)。這說明不同樣地野菊生存外部的環境對內生真菌種類組成的相似性系數也有明顯影響。樣地XS和NW環境差異較大，一個為向陽山坡而另一個為背陰山坡，它們之間野菊花內生真菌的相似數最低。

表1 野菊內生真菌分離率及分布

表2 野菊內生真菌定殖率及多樣性指數

表3 不同樣地野菊內生真菌相似系數

3 討論

研究結果說明野菊內生真菌物種豐富，分布普遍，它們多數為半知菌，少數為子囊菌。其中，刺盤孢菌(Colletotrichum spp.)、擬莖點霉(Phomopsis spp.)、大莖點霉(Macrophoma sp.)3個屬真菌分離率高，且分布廣泛，是野菊優勢內生真菌。內生真菌在供試的野菊各器官均有定殖，且定殖率較高，總體達79.2%～99.3%。環境條件是影響內生真菌群落結構及真菌多樣性的主要因素，宿主組織類型對內生真菌的群落結構也有重要影響。菊科植物內生真菌及生態功能已有研究。曹益鳴等對茅蒼術內生真菌生物多樣性及生態分布進行了研究［9］。茅蒼術和野菊內生真菌比較，二者均具有豐富的內生真菌生物多樣性和明顯的組織專一性，但內生真菌群落結構存在明顯差異，特別是優勢真菌種類完全不同。茅蒼術內生真菌優勢種為鐮孢菌(Fusarium sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、絲核菌菌(Rhizoctonia sp.) 和多腔菌菌(Myriangium sp.)，而野菊內生真菌優勢種為刺盤孢菌(Colletotrichum spp.)、擬莖點霉(Phomopsis spp.)、大莖點霉(Macrophoma sp.)。這說明同一科植物，物種不同其內生真菌群落結構及優勢種也不同;宋文玲等對菊花(Chrysanthemum morifolium)內生真菌的生態功能進行了研究，結果發現，內生真菌葡萄孢

(Botrytis sp.)和毛殼菌(Chaetomium globosum)與菊花建立共生關系后，可以提高菊花產量和品質［10-11］。野菊內生真菌與菊花內生真菌的生態功能是否相同，有待深入研究。另外，據報道，野菊可以產生黃酮類次級代謝產物，具有抗氧化、抗病毒、抗基因誘變、抑菌消炎等多種藥理作用。野菊花內生真菌是否產生具以上功能的黃酮類次級代謝物，需要進一步試驗分析。

［1］朱慶書，趙文英.超聲提取野菊花總黃酮及其抑菌活性的研究［J］.化學與生物工程，2008，25(12)：72-74.

［2］Chang K M，Choi EM，Kimg H.Chemical constituentsof Chrysanthemum indicum L.flower oil and effect on osteoblastic MC3T3-E1 cells［J］.Food Science and Biotechnology，2010，19(3)：815-819.

［3］石瑛.內生真菌對植物生長發育的影響［J］.現代農業科技，2010(6)：36-38.

［4］盧東升，王金平，吳小芹，等.茶樹內生真菌的種類及分布［J］.河南農業科學，2007(10)：54-80.

［5］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學技術出版社，1979.

［6］戴芳瀾.真菌的形態和分類［M］.北京：科學出版社，1987.

［7］邵力平，沈瑞祥，張素軒.真菌分類學［M］.北京：中國林業出版社，1984：1-346.

［8］孫劍秋，郭良棟，臧威，等.藥用植物內生真菌多樣性及生態分布［J］.中國科學 C 輯：生命科學，2008，38(5)：475-484.

［9］曹益鳴，陶金華，江曙，等.茅蒼術內生真菌生物多樣性與生態分布研究［J］.南京中醫藥大學學報，2010，26(2)：137-139.

［10］宋文玲，戴傳超，姜寶娟，等.促進菊花苗期生長的內生真菌篩選與鑒定研究［J］.江蘇農業科學，2009(1)：149-152.

［11］宋文玲，戴傳超，劉曉珍，等.不同內生真菌對菊花產量和品質的影響［J］.中藥材，2010，33(1)：4-7.