電刺激對大鼠脊髓損傷后神經膠質纖維酸性蛋白與白細胞介素-1α表達的影響①

張瑩瑩，李俊岑，饒瑩，楊拯，張曉，鄭蕖，許麗麗

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是嚴重危害人類健康的脊柱脊髓疾患，常致嚴重傷殘，引起各種并發癥，嚴重影響患者的身心健康和生存質量，甚至危及生命。脊髓損傷后，膠質細胞大量增生，膠質瘢痕形成與炎癥反應增強是加重神經損傷和功能障礙的主要原因。電刺激在脊髓功能恢復中具有一定的促進作用，但電刺激對SCI后炎癥反應和膠質瘢痕形成的影響報道較少。電刺激是否有助于減輕SCI后膠質瘢痕形成和炎癥反應呢？

神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)參與膠質瘢痕形成過程；白細胞介素-1α(interleukin-1 alpha,IL-1α)為主要的炎癥因子，其表達的增加是加重炎癥反應和誘導神經元及少突膠質細胞凋亡的主要因素之一。為此，本實驗以GFAP、IL-1α為觀察指標，探討電刺激對大鼠脊髓損傷后不同時段損傷區及附近GFAP、IL-1α表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠72只，雌雄不限，體重(180±20)g，由四川大學實驗動物中心提供，分籠飼養，動物飼養環境溫度20℃～25℃。隨機分為損傷組(n=24)、電刺激組(n=24)和正常組(n=24)。損傷組和電刺激組于造模后l d、3d、5 d、7 d分成4小組，每小組6只。

1.2 動物模型制備 損傷組和電刺激組大鼠均用1.5%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，背部剃毛，常規消毒。以T9為中心，縱行切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉并暴露棘突與椎板，咬除T9椎板，按Allen's法[1]用自行加工設計的打擊裝置，將10 g沖擊棒自25 mm高處自由墜落致傷脊髓。縫合傷口。正常組大鼠僅切除相應椎板后即縫合傷口。術后大鼠獨籠飼養。協助大鼠排尿，每日早晚各1次，至其排尿反射恢復；每日注射青霉素1 ml和生理鹽水2 ml，抗菌和補充體液，持續至大鼠取材。在此期間注意觀察皮膚有無壓瘡或感染、下肢有無潰爛。

1.3 電刺激 術后24 h起對電刺激組大鼠進行經皮電刺激30 min，每天1次。參數設置：疏密波脈沖電流，電流強度中檔，刺激頻率10 Hz，正極接T7右側夾脊穴位置的皮膚，負極接右下肢足三里穴位置的皮膚。連續電刺激至各組動物取材。

1.4 取材及切片處理 各組大鼠分別在術后1 d、3d、5 d、7 d取材。用過量的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，自左心室插管后剪開右心耳，灌注加入肝素鈉與普魯卡因的冰生理鹽水，直到有澄清液從右心耳流出，再灌注4%多聚甲醛1 h。打開椎弓管，切除T7、T9、T11段脊髓，固定24 h后置自動脫水包埋機處理。修片，連續切片，片厚5μm，連續5張進行貼片、烤片，備用。

1.5 免疫組織化學染色 采用非生物素二步法進行GFAP和IL-1α免疫組化染色。將各組切片置于二甲苯中脫臘，梯度酒精水化，高壓熱抗原修復，用3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。分別滴加GFAP抗體(1∶500)或IL-1α抗體(1∶20)，4℃冰箱過夜。用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60 min。加入DAB-H2O2顯色液，室溫下反應，顯微鏡下顯色充分，及時用0.01 mol/L PBS漂洗；蘇木素復染，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。顯微鏡下觀察GFAP、IL-1α的表達，陽性結果為棕黃色反應。

1.6 大鼠后肢運動功能觀察 按照Basso[2]等報道的BBB(Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale)運動功能評分方法進行評定。

1.7 統計學分析 用OLYMPUS數碼照像機采集圖像，觀察GFAP、IL-1α陽性產物在脊髓的分布。分別計數各組術后1 d、3d、5 d、7 d脊髓內、中、外3個視野1028μm2面積內GFAP、IL-1α的陽性細胞數，測量陽性產物的平均積分光密度值。各組陽性細胞數和平均積分光密度值數據以(±s)表示，用SPSS 13.0軟件進行方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 BBB評分 損傷前，3組大鼠BBB評分均為21.00分；損傷后，損傷組、電刺激組BBB評分均小于正常組(P＜0.05)；從損傷后第5天開始，電刺激組BBB評分高于損傷組(P＜0.05)。見表1。

表1 脊髓損傷后不同時間點各組大鼠BBB評分的比較(n=6)

2.2 GFAP 正常組脊髓中央管周圍的室管膜區未見GFAP陽性細胞的表達；室管膜區以外的灰質和白質中偶可見染色程度較弱的GFAP陽性細胞；GFAP陽性細胞突起細長并向四周延伸。損傷1 d后，損傷組和電刺激組可觀察到脊髓損傷區、損傷鄰近區、中央管周圍室管膜區、灰質和白質中GFAP陽性細胞的表達(圖1)；損傷3d后，在損傷區及周圍灰質、白質中GFAP陽性細胞的表達與損傷后1 d相比均增多(P＜0.05)，GFAP陽性細胞肥大，染色變深；損傷3～5 d，GFAP陽性細胞逐漸達到高峰；5 d時損傷組和電刺激組的積分光密度值均達到最高，損傷組高于電刺激組(P＜0.05)(圖1，表2)；損傷7 d后，電刺激組和損傷組GFAP陽性細胞較7 d時減少(圖1)。與損傷組相比，電刺激組變化幅度較小。見表2、表3。

表2 損傷后不同時間點大鼠GFAP平均積分光密度值(n=6)

表3 損傷后不同時間點大鼠GFAP陽性細胞數(n=6)

2.3 IL-1α正常組脊髓灰質前角附近有極少量IL-1α陽性細胞。損傷組損傷后1 d，脊髓灰質前角可見少量IL-1α陽性細胞，呈IL-1α弱染色的突起(圖2)；隨著時間的推移，IL-1α表達量呈遞增趨勢(圖2)，至損傷后7 d，在灰質前角區可見大量的IL-1α免疫反應陽性物(圖2)，并表達量達峰值。電刺激組損傷后1 d和3d，IL-1α陽性表達變化較少(圖2)，5 d后表達量稍有增加(圖2)，7 d后表達量有明顯增加(圖2)。損傷后5 d、7 d時，電刺激組IL-1α的平均積分光密度值低于損傷組(P＜0.05)。見表4、表5。

表4 損傷后不同時間點大鼠IL-1α平均積分光密度值(n=6)

表5 損傷后不同時間點大鼠IL-1α陽性細胞數(n=6)

2.4 GFAP和IL-1α在電刺激組中的相關性 用SPSS 13.0統計軟件對電刺激組中GFAP和IL-1a的陽性細胞數的平均積分光密度值進行Pearson相關分析，GFAP和IL-1α在1～7 d的變化相關(r=0.891,P＜0.05)。

3 討論

GFAP作為星形膠質細胞的主要骨架蛋白之一，是星形膠質細胞的一種特征性標記物[3]。GFAP表達的減少反映星形膠質細胞反應性減弱[4]。星形膠質細胞一方面能提供特殊的軸突再生促進因子或誘導因子，促進或誘導軸突再生；另一方面也可產生阻礙軸突再生的抑制因子或形成局部瘢痕[5-9]。

電刺激能在局部形成“微電池”效應，加速局部代謝，改善局部缺血微環境[10-11]，促進脊髓損傷后神經組織的再生與修復，減輕脊髓的繼發性損傷[12]。

本實驗結果顯示，在電刺激組和損傷組中，脊髓損傷后1～3d，GFAP陽性表達無顯著性差異，但星形膠質細胞在大鼠脊髓損傷后1 d開始活化，1～3d增殖緩慢，這可能與脊髓損傷早期主要表現為局部水腫、出血和組織細胞發生水解壞死，而膠質細胞處于活化初期有關；損傷后5 d兩組GFAP陽性表達到高峰，而損傷后7 d，GFAP陽性細胞減少，在這兩個時間點，電刺激組GFAP表達低于損傷組，提示損傷后5 d可能是電刺激影響星形膠質細胞過度增殖的關鍵時間點。

IL-1α是在感染和炎癥狀態下，由多種細胞產生的、具有多方面生物學功能的細胞因子，主要參與介導炎癥反應、調節免疫及調節機體代謝[13-14]。IL-1α表達減少提示炎癥反應的減弱。有實驗表明，電針督脈可以通過抑制脊髓水腫的程度來減輕脊髓的繼發性損傷[15]；在缺血性腦損傷大鼠，電針明顯抑制大鼠腦組織炎癥反應，減輕缺血再灌注繼發性神經元損傷，對腦缺血再灌注損傷有顯著的保護作用[16]。本實驗結果提示，電刺激可能能抑制受損傷脊髓組織中的IL-1α表達，減輕脊髓損傷后炎癥反應和細胞凋亡。

本實驗提示，脊髓損傷后，GFAP和IL-1α的表達存在相關性。有文獻報道，星形膠質細胞能合成和分泌神經活性物質[17]；而炎癥因子的釋放可導致組織損傷和細胞凋亡，進而反射性促進星形膠質細胞增殖和膠質瘢痕形成[18]。兩者之間存在一定聯系。

脊髓繼發性損傷是在原發性損傷的基礎上觸發的一系列多種分子和細胞參與的復雜過程，對這一過程本質的認識對于控制繼發性損傷，促進脊髓再生修復具有重要意義[19-20]。本研究提示，電刺激在短期內能減少星形膠質細胞增生，降低炎癥因子，創造了有利于運動功能的恢復及神經再生的微環境。但長期電刺激治療的療效情況仍不清楚。

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