高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬外周血細胞的動態變化

孫廣力,蔡雪輝,鄭世民,劉永剛,孫 剛

(1.東北農業大學動物醫學學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江省動物衛生監督所,黑龍江 哈爾濱 150069;3.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所,黑龍江 哈爾濱 150001)

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(high pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)感染仔豬,可引起與血液循環變化密切相關的病理改變。本試驗在以HuN4株PRRSV感染60日齡長白仔豬建立疾病模型基礎上,研究了外周血細胞的動態變化,分析了其與PRRSV載量的關系,旨在探討HP-PRRS的發生、發展及轉歸機制,為HP-PRRS的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病毒 PRRSV HuN 4株(Gen Bank序列登錄號為EF635006),由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所豬傳染病研究室分離、鑒定[1]。

1.2 實驗動物 60日齡長白豬29頭,由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供,經熒光定量 RT-PCR[2]和ELISA方法檢測PRRSV抗原、抗體均為陰性。

1.3 主要儀器設備 ABX-MICROS-60血液分析儀,法國Horiba ABX公司;熒光定量 PCR儀,澳大利亞Corbett Research公司。

1.4 主要試劑 RNeasy Plus Mini RNA試劑盒,Qiagen公司生產;禽源反轉錄酶(AMV)、RNA酶抑制劑、r Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶,均為TaKaRa公司產品;RT-PCR引物和探針由韋天超設計,上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5 試驗設計

1.5.1 實驗動物分組及其處理 29頭仔豬隨機分為:病毒感染組(18頭,簡稱Ⅰ組)和對照組(11頭,簡稱C組)。其中,Ⅰ組仔豬,經滴鼻感染HuN 4株PRRSV稀釋液,3 mL/頭;C組仔豬,經相同途徑給予無PRRSV的細胞培養物。兩組仔豬嚴格隔離,相同條件下分別飼養。

1.5.2 被檢材料的采集 分別于感染后1、3、5、7、14、21、28 、35、42、49 d 和 63 d,經前腔靜脈采血 4 mL。其中,2 m L分離血清,-20℃保存,病毒載量檢測用;2 m L以EDTA-K2抗凝,用于血常規檢測。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 臨床癥狀和病理變化觀察 試驗期內每日測量仔豬體溫,觀察并記錄臨床癥狀。分別于病毒感染后1、3、5、7、14、21、28、35、42、49 d 和 63 d,Ⅰ組剖殺 2頭仔豬,C組剖殺1頭仔豬,檢查病理變化。

1.6.2 血細胞數量檢測及方法 WBC、RBC、HGB、HCT、PLT 等 18項指標,應用 ABX-MICROS-60血液分析儀進行檢測。

1.6.3 病毒載量的檢測 參照文獻[2],采用熒光定量RT-PCR檢測。

引 物 序 列:PNPF:5′-CCCTAGTGAGCGGCAA TTGT-3′;PNPR:5′-TCCAGCGCCCTGATTGAA-3′;探 針 NP-probe:FAM-TCTGTCG TCGA TCCAGA-MGB。

1.7 數據統計分析 數據用Microsoft Office Excel2003電子表格處理,做相關回歸分析及F和t檢驗,分析組間差異。

2 結果

2.1 臨床癥狀和病理變化 PRRS病毒感染仔豬后3 d,體溫開始升高,出現精神沉郁,厭食;第 7天體溫超過41℃,持續7 d,至30 d恢復正常。病毒感染7d后,I組仔豬出現血性眼屎,全身發紺,不能站立,發病率100%;7～14 d,共計死亡5頭,死亡率27.78%;耐過仔豬發育遲緩。對照仔豬未見異常。

死亡和瀕死仔豬病理剖檢可見,肺臟呈暗紅色,表面有不規則出血點或斑;淋巴結體積增大,呈大理石樣外觀;扁桃體出血;脾臟出血、壞死;腎表面有彌漫性針尖大出血點;腦溝、腦回間靜脈顯露、出血;其他臟器靜脈努張、出血。對照仔豬未見異常。

2.2 血細胞變化 PRRSV感染仔豬外周血WBC于感染后 3～42 d顯著下降(P＜0.05);RBC、HGB、HCT在感染后7d顯著下降(P＜0.05),14 d升高(P＜0.05),21 d再下降(P＜0.05),35 d再次升高;MCV、MCH、RDW 與對照仔豬無統計學差異;PLT在病毒感染后3～63 d和3～42 d顯著下降(P＜0.05)(表1)。

2.3 HP-PRRSV感染仔豬外周血病毒載量變化PRRSV感染仔豬外周血 PRRSV RNA于感染后3～63d病毒載量均超過 103copieso/mL;其中,14 d,病毒載量達到最大值,為 109.86±1.24copieso/m L;至 63 d時,仍可檢測到PRRSV RNA(表2)。

2.4 HP-PRRSV感染仔豬外周血血細胞變化與病毒載量的相關性 PRRSV感染仔豬,其病毒載量與WBC、PLT存在中度負相關(0.40＜r＜0.69),與HGB、MCH 存在低度負相關(0.20＜r＜0.39),與 RBC、HCT、MCV、RDW 等相關性可忽略(r＜0.19)(表3)。

3 討論

本試驗結果顯示,PRRSV感染仔豬后,其外周血WBC、PLT 顯著下降,RBC、HGB、HCT、MCV 、MCH、RDW等呈周期性變化;PRRSV感染仔豬外周血病毒載量與WBC、PLT、HGB、MCH 變化存在相關關系。表明PSS RV感染可導致仔豬外周血白細胞、紅細胞和血小板發生病理性改變。

Rossow等[3]報道,SPF豬感染PRRSV后,外周血白細胞減少。羅超[4]研究認為,PRRSV感染初期,仔豬WBC減少主要源于淋巴細胞。WBC減少,特別是淋巴細胞減少,說明PRRS仔豬免疫被抑制。本試驗,病豬WBC減少與病豬表現明顯臨床癥狀及發生死亡時間吻合,提示其與HP-PRRSV感染所致的臨床和病理表現有關,可作為診斷及預后的參考依據。

表1 HP-PRRSV感染仔豬外周血細胞數量動態變化

表2 HP-PRRSV感染仔豬外周血病毒載量

表3 HP-PRRSV感染仔豬外周血細胞與病毒載量相關性

感染性溶血,可表現為RBC、HGB、HCT降低,而MCV、MCH、MCHC不變[6]。急性溶血性貧血時,骨髓造血功能代償性增強,有時臨床上不表現貧血癥狀。本試驗,PRRSV感染仔豬 RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、RDW 變化為典型的急性病毒性溶血,并表現出機體代償特點。

血小板減少是DIC診斷指標之一[7]。羅超[4]和婁忠子等[8]研究證實,HP-PRRS患豬 PLT下降。張妙紅[9]和馬國文[10]等研究認為,HP-PRRS仔豬有局部和全身性血液循環障礙所致的多系統器官衰竭(MODS)、彌散性血管內凝血(DIC)和休克等。本試驗中,感染HP-PRRSV仔豬PLT顯著下降,可能與 HP-PRRS仔豬肺、淋巴結、扁桃體等器官發生水腫、淤血、出血等有關。

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